Аллостерический белок гемоглобин в

Гемоглобин (НЬ) — сложный олигомерный белок, состоящий из 4 протомеров двух типов (2α и 2β), включающих 574 аминокислотных остатка. Содержится в эритроцитах, на его долю приходится до 90% массы белков клетки. Гемоглобин обеспечивает перенос кислорода из легких в ткани и удаление диоксида углерода из тканей.

В мышцах внутриклеточный транспорт и кратковременное депонирование кислорода осуществляет другой белок — миоглобин (Mb). Он не является олигомером, так как состоит только из одной полипептидной цепи, конформация которой очень похожа на пространственную структуру β-цепи гемоглобина (рис. 1.20). Большую часть молекулы

Рис. 1.20. Структура миоглобина иβ-цепи гемоглобина

А— миоглобин; Б— β-цепь гемоглобина

Mb и протомеров Hb составляют 8 α-спиральных участков, образующих глобулу с гидрофобным углублением, в котором находится центр связывания с кислородом (активный центр).При этом полипептидные цепи миоглобина и протомеров гемоглобина идентичны всего на 20%.

Оба белка являются холопротеинами, простетическая группа — гем, который находится в активном центре и участвует во взаимодействии с кислородом (рис. 1.21). Гем (ферропротопорфирин) представляет собой органическое соединение с плоской молекулой, включающей 4 пиррольных цикла и ион железа Fe2+. Он является окрашенным соединением и придает красный цвет гемоглобину, эритроцитам (красные кровяные тельца) и крови.

Гем присоединяется к неполярным радикалам активного центра своими пиррольными циклами, а также к радикалу гистидина с помощью атома Fe. Пиррольные кольца гема расположены в одной плоскости, а ион Fe2+ в неоксигенированом состоянии Hb выступает над плоскостью на 0,6 А. При присоединении кислорода ион железа погружается в плоскость колец гема (рис. 1.22). В результате сдвигается и участок полипептидной цепи, нарушаются слабые связи в молекуле Hb и изменяется конформация всей глобулы. Таким образом, присоединение кислорода вызывает изменение пространственной структуры молекулы миоглобина или протомеров гемоглобина.

Рис. 1.21. Строение гемоглобина и гема

А— гемоглобин— сложный белок, олигомер, состоит из 2 α- и 2 β-субъединиц глобина, каждая имеет центр связывания, где располагается небелковая часть молекулы — гем. Он участвует в присоединении молекулы кислорода. Между протомерами образуется аллостерический центр для присоединения регуляторного лиганда гемоглобина 2,3-бисфосфоглицерата;

Б— гем— простетическая группа гемоглобина, миоглобина и других гемопротеинов. Связывается с глобином гидрофобными связями между пиррольными циклами и гидрофобными радикалами аминокислот. В центре молеку-

2+

лы расположен ион железа (Fe ), который образует 6 координационных связей: 4 — с атомами азота пиррольных колец гема, 1 — с азотом радикала гистидина цепей глобина, 1 — с молекулой кислорода. В присоединении О2к гему участвует еще один радикал гистидина цепи глобина

Рис. 1.22. Взаимодействие кислорода с гемом в миоглобине и гемоглобине

Молекула миоглобина может присоединять только 1 молекулу кислорода в свой активный центр:

Гемоглобин является олигомерным белком и имеет ряд особенностей функционирования, характерных для всех олигомерных белков. Молекула гемоглобина состоит из 4 протомеров и имеет 4 центра связывания О2 (активные центры). Гемоглобин может существовать как в свободной (дезоксигемоглобин), так и в оксигенированной форме, присоединяя до 4 молекул кислорода. Взаимодействие с кислородом 1-го протомера вызывает изменение его конформации, а также кооперативные конформационные изменения остальных протомеров (рис. 1.23, А). Сродство к кислороду возрастает, и присоединение О2 к активному центру 2-го протомера происходит легче, вызывая дальнейшую конформационную перестройку всей молекулы. В результате еще сильнее изменяется структура оставшихся протомеров и их активных центров, взаимодействие с О2 еще больше облегчается. В итоге 4-я молекула кислорода присоединяется к Hb примерно в 300 раз легче, чем 1-я (рис. 1.23, Б). Так происходит в легких при высоком парциальном давлении кислорода. В тканях, где содержание кислорода

ниже, наоборот, отщепление каждой молекулы О2 облегчает освобождение последующих.

Таким образом, взаимодействие олигомерного белка гемоглобина с лигандом (О2) в одном центре связывания приводит к изменению конформации всей молекулы и других, пространственно удаленных центров, расположенных на других субъединицах (принцип «домино»). Подобные взаимосвязанные изменения структуры белка называют кооперативными конформационными изменениями. Они характерны для всех олигомерных белков и используются для регуляции их активности.

Взаимодействие обоих белков (Mb и Hb) с кислородом зависит от его парциального давления в тканях. Эта зависимость имеет разный характер, что связано с их особенностями структуры и функционирования (рис. 1.24).

Гемоглобин имеет S-образную кривую насыщения, которая показывает, что субъединицы белка работают кооперативно, и чем больше кислорода они отдают, тем легче идет освобождение остальных молекул О2. Этот процесс зависит от изменения парциального давления кислорода в тканях.

График насыщения миоглобина кислородом имеет характер простой гиперболы, т.е. насыщение Mb кислородом происходит быстро и отражает его функцию — обратимое связывание с

Рис. 1.23. Кооперативные изменения конформации молекулы гемоглобина при взаимодействии с кислородом

А— при взаимодействии молекулы дезоксигемоглобина НЬ с О2 происходят кооперативные конформационные изменения, которые сопровождают присоединение каждой последующей молекулы кислорода; Б— в результате изменения конформации активного центра возрастает сродство НЬ к кислороду, 4-я молекула кислорода присоединяется к оксигенированному гемоглобину [НЬ(О2)3] в 300 раз легче, чем 1-я

Рис. 1.24. Кривые насыщения миоглобина и гемоглобина кислородом

кислородом, высвобождаемым гемоглобином, и освобождение в случае интенсивной физической нагрузки.

Изменение сродства гемоглобина к О2 обеспечивает быстрое насыщение крови кислородом в легких, а также освобождение и передачу его в ткани. Миоглобин обладает более высоким сродством к О2, поэтому связывает и передает в митохондрии клеток кислород, транспортируемый НЬ в мышцы.

Гемоглобин доставляет в сутки до 600 л (850 г) О2 в ткани и способствует удалению из них ~ 500 л (1000 г) СО2. Движущей силой этих потоков является градиент концентраций О2 между альвеолярным воздухом и межклеточной жидкостью. Парциальное давление О2 в альвеолярном воздухе составляет 100 мм рт.ст. Парциальное давление О2

в тканях намного ниже (~ 40 мм рт.ст.), что обусловлено поступлением и использованием кислорода митохондриями клеток, где он превращается в Н2О. Таким образом О2 поглощается клетками.

Обмен О2 и СО2 происходит в капиллярах: в легких О2 переходит из альвеолярного воздуха в эритроциты, а СО2 — в обратном направлении; в капиллярах тканей О2 из эритроцитов перемещается в клетки тканей, а СО2 — в обратном направлении (рис. 1.25).

Изменение функциональной активности белка при взаимодействии с другими лигандами вследствие конформационных изменений называется аллостерической регуляцией, а соединения-регуляторы — аллостерическими лигандами. Способность к аллостерической регуляции характерна, как правило, для олигомерных белков, т.е. для проявления аллостерического эффекта необходимо взаимодействие протомеров. При воздействии аллостерических лигандов белки меняют свою конформацию (в том числе и активного центра) и функцию.

Молекула гемоглобина способна связываться с несколькими лигандами: О2, Н+, СО2, 2,3-бис- фосфоглицератом (БФГ). Н+, СО2 и БФГ являются аллостерическими регуляторами активности гемоглобина и присоединяются к участкам (аллостерическим центрам), пространственно удаленным от активного центра.

Концентрация аллостерических лигандов снижает сродство гемоглобина к кислороду, а миоглобин и отдельные субъединицы гемоглобина нечувствительны к изменениям концентрации Н+, СО2 и БФГ, т.е. аллостерические свойства гемоглобина возникают только в результате взаимодействия субъединиц.

Рис. 1.25. Перенос кислорода и диоксида углерода гемоглобином. Эффект Бора

БФГ образуется из глюкозы в эритроцитах и является одним из регуляторов работы гемоглобина. Его молярная концентрация в крови близка к молярной концентрации НЬ. В центре молекулы гемоглобина полипептидные цепи 4 протомеров образуют полость (аллостерический центр), причем величина ее увеличивается в дезоксигемоглобине и уменьшается в оксигемоглобине. БФГ поступает в полость дезоксигемоглобина, связываясь с положительно заряженными группами на β-протомере (рис. 1.26). При этом его сродство к О2 снижается в 26 раз. В результате происходит высвобождение кислорода в капиллярах ткани при низком парциальном давлении О2.

Рис. 1.26. Связывание БФГ с дезоксигемоглобином

Центр связывания БФГ находится в положительно заряженной полости между 4 протомерами гемоглобина. Взаимодействие БФГ с центром связывания изменяет конформацию α- и β-протомеров НЬ и их активных центров. Сродство НЬ к молекулам О2 снижается и кислород высвобождается в ткани. В легких при высоком парциальном давлении О2 активные центры гемоглобина насыщаются за счет изменения конформации и БФГ вытесняется из аллостерического центра

В легких высокое парциальное давление О2, наоборот, приводит к оксигенированию НЬ и освобождению БФГ.

Содержание БФГ в крови человека соответствует содержанию гемоглобина и повышается при понижении содержания кислорода в воздухе (гипоксии) или затруднении дыхания при заболеваниях легких. Понижение его концентрации ухудшает снабжение тканей кислородом.

Это важно учитывать при переливании крови и сохранять необходимую концентрацию БФГ при консервации. Переливание донорской крови с пониженным содержанием БФГ может привести к гипоксии и гибели больных.

В регуляции работы гемоглобина основная роль принадлежит протонам Н+. • В ткани НЬ поступает преимущественно в виде НЬ(О2)4. Но при низком парциальном давлении О2 происходит отщепление части кислорода. Увеличение содержания не полностью оксигенированных форм НЬ облегчает высвобождение О2.

В мышцах образуется много СО2, который под действием карбоангидразы превращается в угольную кислоту Н2СО3, диссоциирующую на Н+ и бикарбонат-ион:

СО2 + Н2О → Н2СО3 → Н+ + НСО3-

Повышение концентрации Н+ вызывает протонирование ионогенных групп НЬ, что приводит к снижению его сродства к О2:

Н+ + НЬ О2 → Н+ НЬ + О2

Далее с дезоксигемоглобином взаимодействует

БФГ:

В легкие поступает кровь с высоким содержанием дезоксигемоглобина, протонированного, связанного с БФГ или СО2. В такой форме гемоглобин имеет пониженное сродство к О2.

Из капилляров диффундирует СО2, освобождающийся в результате реакции:

Н+ + НСО-3 → Н2СО3 → СО2 + Н2О

Это стимулирует депротонирование гемоглобина:

Н+ НЬ → Н+ + НЬ

Высокое парциальное давление О2 приводит к оксигенированию НЬ, при этом вытесняется БФГ:

НЬ БФГ → НЬ + БФГ

Частичное оксигенирование гемоглобина повышает его сродство к кислороду, все реакции, приведенные выше, происходят в обратном порядке.

Зависимость сродства гемоглобина к кислороду от концентрации ионов водорода (Н+) получила название эффекта Бора по имени датского физиолога, изучавшего функционирование гемоглобина (см. рис. 1.25).

Таким образом, количество транспортируемого гемоглобином в ткани кислорода регулируется и повышается при увеличении содержания СО2 и Н+ в крови (например, при интенсивной физической работе); при сдвиге рН крови в щелочную сторону (алкалозе) доставка кислорода в ткани понижается.

ЧАСТЬ I. КОНФОРМАЦИЯ И ДИНАМИКА

ГЛАВА 4. ГЕМОГЛОБИН: АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЙ БЕЛОК

4.6. Клиническое значение биофосфоглицерата

Выявление роли БФГ в транспорте кислорода сыграло важную роль в нескольких областях клинической медицины. Так, например, на протяжении ряда лет оставалось непонятным, почему в крови, консервированной в среде кислота-цитрат-декстроза (общепринятая для консервирования крови среда), сродство к кислороду возрастает: Р50 становится равным 16 вместо 26 торр. Теперь установлено, что повышение сродства к кислороду обусловлено одновременным снижением содержания БФГ с 4,5 до менее чем 0,5 мМ за 10 дней хранения крови. Сродство консервированной крови к кислороду имеет крайне важное значение в клинических условиях. Если больному переливают большое количество крови с высоким сродством к кислороду, то возникает опасность недостаточного снабжения кислородом тканей. Попавшие в кровяное русло эритроциты, полностью лишенные БФГ, восстанавливают половину его нормального содержания за 24 ч. Этот срок может оказаться неприемлемым для тяжелых больных. Таким образом, в определенных условиях следует обращать внимание на то, чтобы при переливании крови больной получил эритроциты с нормальным сродством к кислороду. Добавлением БФГ нельзя повысить его содержание в эритроцитах, так как БФГ, обладая высоким зарядом, не проходит через клеточную мембрану. Можно, однако, предотвратить снижение концентрации БФГ в консервированных клетках, добавляя в среду инозин. Незаряженные молекулы инозина проходят через мембрану эритроцита и внутри клетки в результате сложной серии реакций (разд. 15.4) превращаются в БФГ. В настоящее время инозин широко используется для сохранения функциональной полноценности консервированной крови.

Открытие роли БФГ позволило также понять и некоторые адаптивные механизмы, включающиеся при нарушении снабжения тканей кислородом (т.е. при гипоксии). Возьмем для примера больных с тяжелой обструктивной эмфиземой легких. При этом заболевании затруднено поступление воздуха в бронхиолы; в результате артериальная кровь недостаточно насыщается кислородом. рO2 в артериальной крови таких больных составляет только 50 торр, т. е. оно вдвое ниже, чем в норме. Но при этом происходит компенсаторный сдвиг кривой насыщения кислородом, обусловленный повышением концентрации БФГ с 4,5 до 8,0 мМ. При таком содержании БФГ Р50 становится равным уже не 26, а 31 торр. При Р50 = = 31 торр насыщение кислородом в артериях (УА!!!) составляет 0,82, а в венах (Уу) — 0,49; артериовенозная разница (∆У) равна 0,33. При нормальном значении Р50 (Р50 = = 26 торр) УА = 0,86, Уу = 0,60 и ∆У = 0,26. Сдвиг кривой диссоциации кислорода создает то преимущество, что увеличивает ∆У с 0,26 до 0,33. Таким образом, повышение концентрации БФГ приводит к увеличению доставки кислорода в ткани на 27%.

При некоторых нарушениях обмена веществ в эритроцитах содержание БФГ изменяется, что сопровождается соответственным изменением сродства гемоглобина к кислороду. Эти нарушения обсуждаются в одной из следующих глав (разд. 12.18).

Нерешенной проблемой физиологии дыхания является механизм адаптации к высоте. И в этом случае изменение уровня в содержании БФГ имеет, по-видимому, существенное значение. Когда человек поднимается от уровня моря на высоту 4500 м, уже через 2 дня концентрация БФГ в его эритроцитах возрастает с 4,5 до 7,0 мМ и соответственно снижается сродство к кислороду. Насыщение артериальной крови кислородом уменьшается из-за снижения Р50, но количество транспортируемого кислорода возрастает (возрастает ∆У), так как больше высвобождается кислорода в капиллярной сети. При спуске с гор на уровень моря концентрации БФГ и Р50 возвращаются к исходным величинам.

4.7. Гемоглобин плода характеризуется высоким сродством к кислороду

Эмбрионам свойственен особый тип гемоглобина — гемоглобин F (α2γ2), который, как уже упоминалось ранее, отличается от гемоглобина взрослых. Важнейшая особенность гемоглобина F состоит в том, что в физиологических условиях его сродство к кислороду выше, чем сродство к кислороду у гемоглобина А (рис. 4.9). Более высокое сродство к кислороду гемоглобина F создает оптимальные условия для транспорта кислорода из крови матери в кровь плода. Гемоглобин F оксигенируется за счет гемоглобина А (находящегося по другую сторону трансплацентарного барьера в кровеносной системе плаценты).

Рис. 4.9. Эритроциты плода обладают более высоким сродством к кислороду, чем эритроциты матери. В присутствии бисфосфоглицерата сродство к кислороду гемоглобина плода выше, чем у гемоглобина матери

Высокое сродство крови плода к кислороду известно уже на протяжении многих лет, однако причина этого явления выяснилась лишь недавно. Оказалось, что гемоглобин F слабее связывает БФГ, чем гемоглобин А, и, следовательно, обладает более высоким сродством к O2. В самом деле, в отсутствие БФГ величины сродства этих гемоглобинов располагаются в обратном порядке. Это казалось загадочным до тех пор, пока не выяснилось, что экспериментальное определение кривых диссоциации кислорода следует проводить при добавлении БФГ, поскольку это соединение присутствует в эритроцитах как плода, так и взрослого.

4.8. Для проявления аллостерического эффекта необходимо взаимодействие субъединиц

Рассмотрим структурную основу аллостерических эффектов. Гемоглобин можно расщепить на составляющие его полипептидные субъединицы. Выделенные а-цепи гемоглобина по своим свойствам имеют много общего с миоглобином. Сама по себе α-цепь характеризуется высоким сродством к кислороду, гиперболической кривой диссоциации кислорода и таким связыванием O2, которое нечувствительно к изменению pH, концентрации СO2 и содержанию БФГ. Изолированные р-цепи легко образуют тетрамер β4, называемый гемоглобином Н. Подобно α-цепи и миоглобину, β4 полностью лишен аллостерических свойств. Отсюда следует, что аллостерические свойства гемоглобина возникают в результате взаимодействия субъединиц. Функциональная единица гемоглобина-это тетрамер, состоящий из полипептидных цепей двух типов.

4.9. Четвертичная структура гемоглобина значительно изменяется при оксигенировании

В 1937 г. Феликс Гауровиц (F. Haurowitz) обнаружил, что кристаллы дезоксигемоглобина при оксигенировании разрушаются. Объясняется это тем, что структура оксигемоглобина заметно отличается от структуры дезоксигемоглобина и оксигенированные молекулы уже не укладываются в кристаллическую решетку дезоксигемоглобина. В противоположность этому на кристаллы миоглобина, так же, как и на кристаллы β4, оксигенирование не влияет.

Как показал рентгеноструктурный анализ, окси- и дезоксигемоглобин существенно различаются по четвертичной структуре (рис. 4.10). Оксигенированная молекула более компактна. Например, при присоединении O2 расстояние между атомами железа в р-цепях уменьшается с 39,9 до 33,4 А. Особый интерес представляют изменения в области контактов между α- и β-цепями. Существуют два типа контактов между α и β-цепями, обозначаемые соответственно α1β1- и α1β2-контактами (рис. 4.11). При переходе гемоглобина из окси- в дезоксиформу α1β1-контакт практически не меняется, тогда как а1β2-контакт претерпевает большие структурные изменения. В результате присоединения кислорода одна пара субъединиц ар поворачивается относительно другой пары αβ на 15° (рис. 4.12). Некоторые атомы в этой области раздела перемещаются на расстояние, достигающее 6 А. По существу, область контакта α1 функционирует как переключатель с одной структуры на другую. Каждая из форм такого похожего на ласточкин хвост контакта стабилизирована собственным набором водородных связей (рис. 4.13).

Рис. 4.10. Проекция части карт электронных плотностей оксигемоглобина (красный) и дезоксигемоглобина (синий), полученная при разрешении 5,5 А. Показаны спирали А и Н двух Р!!!-цепей гемоглобина. Центральная часть схемы соответствует центральному углублению в молекуле. Здесь показано одно из конформационных изменений гемоглобина, сопутствующих присоединению кислорода, а именно сближение двух Н-спиралей

Рис. 4.11. Модель оксигемоглобина при низком разрешении. Показаны два вида контактов между α и β-цепями. α-Цепи изображены белым, β-цепи-серым. Три гема, видные на модели, обозначены буквой Н. Область α2β1-контактов показана синим, а a^-контакта- желтым

Рис. 4.12. Схема, иллюстрирующая изменения четвертичной структуры гемоглобина при оксигенировании. Одна пара αβ- субъединиц сдвигается по отношению к другой путем поворота на 15° и продвижения на 0,8 А. Оксиформа повернутой пары оф!!!-субъединиц показана красным, дезоксиформа-синим

Рис. 4.13. Область о^р2-контакта при оксигенировании переходит от Т-формы к R-форме. Конфигурация контактирующих поверхностей в виде ласточкина хвоста позволяет двум субъединицам легко скользить относительно друг друга

Контакт α1β2 расположен вблизи гемов. Следовательно, структурные изменения в этой области могут оказывать влияние на гем. Важное значение контакта подтверждается также и тем, что у всех позвоночных он состоит в основном из одних и тех же аминокислотных остатков. Кроме того, практически при всех мутациях, затрагивающих контакт α1β2, взаимодействие гем—гем оказывается сниженным, тогда как при мутациях контакта α1β1 этого не происходит.