Фотометрический метод измерения гемоглобина

Клиническое значение определения гемоглобина

У взрослого человека норма концентрации Hb зависит от пола:

• женщины 11-14г/% или 110-140 г/л;
• мужчины 12-16 г/% или 120-160 г/л.

Для мужчин норма более завышена, так как они имеют большую мышечную массу, по сравнению с женщинами.

Снижение концентрации гемоглобина наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:

• сниженная концентрация эритроцитов в следствии железодефицитной, серповидно-клеточной анемии;
• недостаточное количество веществ, которые влияют на продукцию эритроцитов (фолиевая кислота, витамин B12);
• заболевание красного костного мозга.

Повышенная концентрация Hb наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:

• повышенная продукция эритроцитов при заболевании красного костного мозга, злокачественных новообразованиях;
• компенсаторное повышение количества эритроцитов вследствие сердечно-сосудистых и легочных заболеваний;
• снижение количества плазмы крови вследствие чего число форменных элементов повышается в 1 л биологической жидкости.

Гемоглобин появляется в эритроцитах после утраты ядра и приобретении зрелости клетки. Местом утилизации красных кровяных клеток и Hb является селезенка. Жизненный цикл 1 клетки совместно составляет 120 дней. После гибели в кровь выделяется железо, которое поставляется в красный костный мозг. С помощью этого элемента продуцируются новые красные кровяные тельца.

Методы измерения гемоглобина в крови

Существуют следующие методы анализа гемоглобина в биологической жидкости:

• гемиглобинцианидный;
• гемихромный;
• Сали;
• аммиачный;

После использования соответствующей методики чаще всего применяют полуавтоматический анализатор, который измеряет спектр длины волны молекулы Hb.

Подсчет показателей осуществляется не только в крови, но и в моче, так как в мочевыделительной системе возможны небольшие или значительные кровотечения.

Полуавтоматический гематологический анализатор полностью исключают реставрации врачебные ошибки в отчете необходимого значения. Но прибор не сможет увидеть и распознать нарушение различных параметров.

Ручной подсчет основывается на применении реактива и биологической жидкости. Метод не подсчитывает число клеток, а определяется их присутствие или отсутствие. Подходит для мочи

Унифицированные методы определения гемоглобина

Унифицированная методика – способы измерения показателей, применяемые в большинстве лаборатории. Являются точными, быстрыми, практичными. Для Hb это гемицианидный метод с фотоколориметрическим подсчетом. Позволяет выявить точное количество показателя с помощью подсчета длины волны на специализированном полуавтоматическом приборе.

Второй унифицированной методикой является гимехромный способ. Его принцип тот же, но используются более качественные реактивы, которые не приносят вреда здоровью врачей.

Гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина в крови

У гемоглобина имеется множество форм, поэтому рассчитать длину его волны очень сложно. Для упрощения подсчета применяют специализированные химические вещества, которые переводит его в метгемоглобин.

Для получения точных результатов необходимо использовать трансформирующий раствор, специализированные измерительные пробирки, фотоэлектроколориметр. Hb имеет длину волны 540 м. Именно в таком пределе прибор подсчитывает заданный показатель.

Полученные данные подставляют в формулу, которая переводит общее количество показатели в граммы на литры (г/л).

Важно! На данный момент метод определения концентрации гемоглобина в крови используется редко, так как применяемые реактивы опасны для жизни и здоровья в врачей-лаборантов. При нарушении правил приготовления могут возникнуть ожоги кожных покровов и слизистых оболочек.

Читай подробно о гемиглобинцианидном методе в отдельной статье!

Гемихромный метод определения гемоглобина в крови

С помощью методики Hb переводится в циангемоглобин с помощью реактивов, которые полностью безопасны для человека. Для этого используют цианистые соединения (натрий додецилсульфат, лаурилсульфат).

Образуется гемихром, который подсчитывается при длине волны 540 нм. Полученные данные подставляют в формулу для перевода показателя в г/л.

Подробная статья о гемихромном методе определения гемоглобина.

Цианидный метод исследования гемоглобина в крови

Для проведения анализа используют капиллярную и венозную кровь. В биологическую жидкость человека добавляют трансформирующий раствор. С помощью него происходит преобразование всех форм Hb в метгемоглобин.

В пробирку наливают 5 мл реагента и 20 мкл биологической жидкости. Выжидают 10 минут, пока произойдет реакция. Полученную жидкость заливают в специальную кювету, фотоэлектроколориметр пропускает через нее лучи, подсчитывает элементы в области длины волны, равной 543 нм. Содержание Hb рассчитывается по формуле с помощью полученных показателей.

Метод Сали для определения гемоглобина в крови

Определение количества гемоглобина по методу Сали редко применяется в клинических учреждениях, так как существуют более совершенные способы.

Получают биологическую жидкость человека, в которую добавляют хлористоводородная кислоту. Раствор тщательно перемешивают. Это позволяет Hb перейти в другую форму – солянокислый гематин. Добавляют дистиллированную воду до тех пор, пока окрашивание не будет идентичным с контрольной пробиркой (коричневый цвет).

На нижнем мениске пробирки будет стоять цифра, которая указывает на содержание показателя в 100 г крови. Для вычисления концентрации в 1 литре, показатели умножают на 10. Процентное содержание Hb вычисляется с помощью пропорции:

16,7%=100

• А%=Х
• Х=А×100/16,7
• Х – определяемый показатель,
• А – полученное число гемоглобина с помощью гемометра,
• 16,7 – процентное количество гемоглобина в контрольной пробе.

Метод спектрального анализа для измерения гемоглобина

Наиболее точным методом определения гемоглобина является использование спектрофотометра. Он определяет только 1 из форм гемоглобина, улавливая длину его волны. В крови человека существуют различные формы Hb:

• Оксигемоглобин;
• Дезоксигемоглобин;
• Карбоксигемоглобин;
• Метгемоглобин.

Для исследования с помощью спектрофотометра необходим перевод показателей только в 1 из форм. Для этого применяют различные реактивы. Показатель окрашивается определенным цветом (красный, зеленый). Его длину волны улавливает прибор, подсчитывает все элементы в заданной траектории.

Аммиачный метод определения гемоглобина

Аммиачный метод количественного определения гемоглобина соответствует предыдущим способам. Разницу составляет использование аммиака в концентрации 0,04%. Проба должна настояться, чтобы произошла реакция перехода всех форм Hb в одну. Ее рассчитывают с помощью полуавтоматического анализатора в виде спектрофотометра. Раствор помещают в кювету, устанавливают в прибор. Рассчитывают показатель на длине волны 543 нанометров.

Методы определения гемоглобина в моче

Существует 4 разновидности исследования мочи. Каждая из них отличается применяемыми реактивами. Для исследования собирают только свежую порцию урины. Если она настоится, Hb превратиться в медгемоглобин, Поэтому реакция будет невозможна. Урину подготавливают. Для этого к ней добавляет 2 мл уксусной кислоты и 5 мл диэтилового эфира.

• Реакция с гваяковой кислотой. Разводят щепотку кислоты, добавляют 3 мл этанола 96%. Добавляют 8-10 капель получившейся жидкости к 8-10 каплям разведенной урины. Если Hb присутствует в образце, он окрашивается в синий цвет.
• Реакция с амидопирином. К 2-3 мл разведенной урины добавляют 10 капель раствора амидопирина и 10 капель 3% перекиси водорода. Если Hb присутствует, урина окрашивается в фиолетовый цвет.
• Реакция с бензидином. В пробирку добавляют 6 капель бензидина, 6 капель 3% перекиси водорода,4 капли чистой урины. Если Hb присутствует, получившаяся жидкость окрашивается в зеленый цвет.
• Использование тест-полосок, таблеток. Они содержат специализированные реактивы в готовом виде. Полоски опускают в мочу, достают, оценивают цветовую шкалу. Таблетки полностью растворяют в биологической жидкости человека. Индикаторная шкала подписана на упаковке.

Какой метод определения гемоглобина наиболее точный?

Наиболее точным методом определения показателя считается фотоколориметрический с использованием гемихромного разведения. С помощью него снижается риск врачебной ошибки. Прибор автоматически подсчитывает показатель. Здесь важно правильно подготовить приборы, пробирки, кюветы, настроить аппарат. Методика безопасна для лаборанта.

В определении Hb в моче наиболее информативным является использование тест-полосок. Здесь полностью исключается риск неправильного разведения реактивов. 

Определение гемоглобина является важным информативным тестом. Можно определить кровотечение в мочевыводящих путях, состояние сердечно-сосудистой и легочной системы. С помощью методов вовремя выявляются различные виды анемии при низких концентрациях гемоглобина. После получения данных рекомендуется обратиться к лечащему врачу. Он расшифрует полученный результат, выявит нормы и отклонения, назначит лечение. 

Узнай о методах определения гликозилированного гемоглобина в крови!

Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro

Полезное видео

Â.Ì.Äàâûäîâ, Å.Í.Îâàíåñîâ, È.Â.Ñåöêî

Ê ÂÎÏÐÎÑÓ Î ÒÎ×ÍÎÑÒÈ ÔÎÒÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÎÃÎ ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈß ÊÎÍÖÅÍÒÐÀÖÈÈ ÃÅÌÎÃËÎÁÈÍÀ

Íàó÷íî-ïðîèçâîäñòâåííîå ïðåäïðèÿòèå «Òåõíîìåäèêà»,
Ìîñêâà

Äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîíöåíòðàöèè ãåìîãëîáèíà ôîòîìåòðè÷åñêèì ìåòîäîì êðîâü îáðàáàòûâàþò, êàê ïðàâèëî, â òðàíñôîðìèðóþùåì ðàñòâîðå, ÷òîáû ïîäãîòîâëåííàÿ äëÿ ôîòîìåòðèðîâàíèÿ ïðîáà èìåëà îïðåäåëåííûå îïòè÷åñêèå ïàðàìåòðû. Êðîìå îïòè÷åñêîé ïðîçðà÷íîñòè, âàæíîå çíà÷åíèå èìååò ñïåêòðàëüíûé ñîñòàâ æèäêîñòè. Èìåííî ñïåêòðàëüíûé ñîñòàâ ïðîáû îïðåäåëÿåò ñïîñîá ôîòîìåòðèðîâàíèÿ è òî÷íîñòü îïðåäåëåíèÿ êîíöåíòðàöèè ãåìîãëîáèíà. Âûáîð òðàíñôîðìèðóþùåãî ðàñòâîðà ìîòèâèðóåòñÿ êàê òðåáîâàíèÿìè ê íàäåæíîñòè èçìåðåíèé, òàê è ê óäîáñòâó è ê áåçîïàñíîñòè ðàáîòû ñ íèì.  60-õ ãîäàõ â ëàáîðàòîðíîé ïðàêòèêå èñïîëüçîâàëñÿ îêñèãåìîãëîáèíîâûé ìåòîä ñ òðàíñôîðìèðóþùèì ðàñòâîðîì 0,04% àììèàêà â âîäå è ôîòîìåòðèðîâàíèåì íà äëèíå âîëíû 540 íì. Âðåìÿ ïîäãîòîâêè ôîòîìåòðè÷åñêîé ïðîáû ñîñòàâëÿåò 1-2 ñ. Ïðè ýòîì ìåòîäå ïðîáà ñîäåðæèò íåñêîëüêî ïðîèçâîäíûõ ãåìîãëîáèíà, èìåþùèõ ðàçëè÷íûé ñïåêòð ïîãëîùåíèÿ — îêñèãåìîãëîáèí, êàðáîêñèãåìîãëîáèí. ìåòãåìîãëîáèí è ñóëüôîãåìîãëîáèí. Íåñìîòðÿ íà òî ÷òî ïðè ðÿäå çàáîëåâàíèé è îñîáåííî ïðè îòðàâëåíèè àíèëèíîì è åãî ïðîèçâîäíûìè ñóëüôîãåìîãëîáèí ìîæåò íàêàïëèâàòüñÿ â êðîâè, åãî âëèÿíèå ñ÷èòàåòñÿ íåçíà÷èòåëüíûì. Ñðåäè äðóãèõ ïðîèçâîäíûõ îêñèãåìîãëîáèí è êàðáîêñèãåìîãëîáèí èìåþò îäèíàêîâîå ïîãëîùåíèå íà äëèíå âîëíû 540 íì, íà êîòîðîé è ïðîâîäèëèñü èçìåðåíèÿ. Îäíàêî ó ìåòãåìîãëîáèíà íà ýòîé äëè íå âîëíû ïîãëîùåíèå äðóãîå, è ðåçóëüòàò ôîòîìåòðè÷åñêîãî èçìåðåíèÿ çàâèñèò îò ñîîòíîøåíèÿ ïðîèçâîäíûõ â ïðîáå. Ê òîìó æå ýòî ñîîòíîøåíèå èçìåíÿåòñÿ âî âðåìåíè, òàê êàê îêñèãåìîãëîáèí ïåðåõîäèò â ìåòãåìîãëîáèí.

Íà ñìåíó îêñèãåìîãëîáèíîâîìó ìåòîäó ïðèøåë ðåêîìåíäîâàííûé ÂÎÇ ãåìèãëîáèíöèàíèäíûé ìåòîä, èñïîëüçóþùèé äëÿ ôîòîìåòðèðîâàíèÿ ðàñòâîð ãåìèãëîáèíöèàíèäà — ôîðìó, â êîòîðóþ ïåðåâîäÿòñÿ îñíîâíûå ïðîèçâîäíûå ãåìîãëîáèíà, êðîìå, îïÿòü æå, ñóëüôîãåìîãëîáèíà. Ðàñòâîð ãåìèãëîáèíöèàíèäà ñòîéêèé âî âðåìåíè è èìååò ìàêñèìóì ïîãëîùåíèÿ íà äëèíå 540 íì, íà êîòîðîé è ïðîèçâîäèòñÿ ôîòîìåòðèðîâàíèå. Òî÷íîñòü ìåòîäà 2% áåç ó÷åòà âëèÿíèÿ ñóëüôîãåìîãëîáèíà, ÷òî äîñòàòî÷íî äëÿ øèðîêîé ìåäèöèíñêîé ïðàêòèêè. Íåäîñòàòêîì ìåòîäà ÿâëÿåòñÿ íàëè÷èå â òðàíñôîðìèðóþùåì ðàñòâîðå âðåäíûõ öèàíèñòûõ ñîåäèíåíèé è äëèòåëüíîå (äî 20 ìèí) âðåìÿ ðåàêöèè.

 òî æå âðåìÿ îêñèãåìîãëîáèíîâûé ìåòîä â îïðåäåëåííûõ óñëîâèÿõ äàåò ðåçóëüòàòû, íå óñòóïàþùèå òàêîâûì ãåìèãëîáèíöèàíèäíîìó. Àâòîðû èçó÷èëè òî÷íîñòíûå õàðàêòåðèñòèêè îêñèãåìîãëîáèíîâîãî ìåòîäà ïðè ôîòîìåòðèðîâàíèè íà äëèíå âîëíû 523 íì â óçêîé ñïåêòðàëüíîé ïîëîñå 10 íì.  ýòîì ñëó÷àå îêñè- è ìåòïðîèçâîäíûå ãåìîãëîáèíà èìåþò îäèíàêîâûé ìèëëèìîëÿðíûé êîýôôèöèåíò ïîãëîùåíèÿ 7,12 è ôàêòîð ïåðåõîäà ñî âðåìåíåì îêñèôîðìû â ìåòôîðìó íå èçìåíÿåò îïòè÷åñêîãî ïîãëîùåíèÿ ïðîáû. Êàðáîêñèãåìîãëîáèí òàêæå ÿâëÿåòñÿ óñòîé÷èâîé ôîðìîé, íî èìååò íà ýòîé äëèíå âîëíû äðóãîé êîýôôèöèåíò ïîãëîùåíèÿ — 10,3, è ýòî ìîæåò áûòü èñòî÷íèêîì îøèáêè èçìåðåíèÿ ïðè íàëè÷èè â ïðîáå ýòîé ôîðìû. Íàøè ñïåêòðîìåòðè÷åñêèå èññëåäîâàíèÿ ðàñòâîðîâ êðîâè ïîêàçàëè, ÷òî ïðè ðàçâåäåíèè êðîâè ñëàáûì ðàñòâîðîì àììèàêà ÷àñòü êàðáîêñèãåìîãëîáèíà âñå æå îêèñëÿåòñÿ ïîä âëèÿíèåì ñèëüíîãî ðàçëè÷èÿ ïàðöèàëüíîãî äàâëåíèÿ ÑÎ â êðîâè è â ðàñòâîðå, ãäå åãî ôàêòè÷åñêè íåò. Îñòàâøàÿñÿ ÷àñòü âíîñèò ìåòîäè÷åñêóþ îøèáêó, ðàâíóþ ïðèìåðíî 1/6 îò ïðîöåíòíîãî ñîäåðæàíèÿ êàðáîêñèãåìîãëîáèíà â êðîâè. Ðåçóëüòàòû ñïåêòðîìåòðè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé ïîäòâåðäèëèñü ïðè èçìåðåíèÿõ íà ãåìîãëîáèíîìåòðå «ÌèíèÃÅÌ-523», â êîòîðîì ðåàëèçîâàíà ìåòîäèêà ôîòîìåòðèðîâàíèÿ íà äëèíå âîëíû 523 íì â óçêîé ñïåêòðàëüíîé ïîëîñå. Ïîÿâëåíèå êàðáîêñèãåìîãëîáèíà â êðîâè ñâÿçàíî, êàê ïðàâèëî, ñ îòðàâëåíèåì óãàðíûì ãàçîì âî âðåìÿ êóðåíèÿ èëè ïîæàðîâ. Ñîäåðæàíèå êàðáîêñèãåìîãëîáèíà â êðîâè ìíîãî êóðÿùèõ ïàöèåíòîâ ñîñòàâëÿåò 3-5%; ïðè îòðàâëåíèè óãàðíûì ãàçîì ñ ñèìïòîìàìè ðàñøèðåíèÿ êîæíûõ ñîñóäîâ è íàïðÿæåíèåì âî ëáó — 10%; ñ ñèìïòîìàìè ðåçêîé ãîëîâíîé áîëè, óñòàëîñòè, ãîëîâîêðóæåíèÿ, îñëàáëåííîãî çðåíèÿ, òîøíîòû, ðâîòû — 30%, ñ ñèìïòîìàìè êîìû, êîíâóëüñèé, äûõàíèÿ Cheyne-Stokes — 50%.

Ýòî îçíà÷àåò, ÷òî äëÿ âñåõ ñëó÷àåâ, íå ñâÿçàííûõ ñ ñèëüíûì îòðàâëåíèåì óãàðíûì ãàçîì (áîëåå 12%), ìåòîäè÷åñêàÿ îøèáêà èçìåðåíèÿ èññëåäóåìûì ìåòîäîì íå ïðåâûøàåò 2%, êàê è â ãåìèãëîáèíöèàíèäíîì ìåòîäå. Ó÷åñòü çàâûøåíèå ðåçóëüòàòîâ èçìåðåíèÿ â ñëó÷àÿõ îòðàâëåíèÿ äîñòàòî÷íî ïðîñòî, îðèåíòèðóÿñü íà âíåøíèå ïðèçíàêè îòðàâëåíèÿ.

Òàêèì îáðàçîì, ìîäèôèöèðîâàííûé îêñèãåìîãëîáèíîâûé ìåòîä, íå óñòóïàÿ â îñíîâíîì ãñìèãëîáèíöèàíèäíîìó ìåòîäó ïî òî÷íîñòè èçìåðåíèÿ, îáëàäàåò òàêèìè ïðåèìóùåñòâàìè, êàê ìàëîå âðåìÿ ïîäãîòîâêè ôîòîìåòðè÷åñêîé ïðîáû (2 ñ) è îòñóòñòâèå â òðàíñôîðìèðóþùåì ðàñòâîðå âûñîêîòîêñè÷íûõ âåùåñòâ.

ÍÎÂÎÑÒÈ
ÀÑÑÎÖÈÀÖÈß
ÎÁÐÀÇÎÂÀÍÈÅ
ÍÀÓÊÀ
ÁÈÁËÈÎÒÅÊÀ
ÍÎÐÌÀÒÈÂÛ
ÎÁÚÅÄÈÍÅÍÈß
ÎÑÍÀÙÅÍÈÅ
ÊÀ×ÅÑÒÂÎ