Гемиглобинцианидный метод измерения гемоглобина крови
Содержание статьи
ГЕМОГЛОБИН АГАТ
Руководитель Департамента государственного контроля
качества, эффективности, безопасности лекарственных
средств и медицинской техники МЗ РФ
Р.У. Хабриев
17.06.2000 г.
Рекомендована к утверждению
Комиссией по лабораторным реагентам
Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ
(протокол № 1 от 31.01.2000 г.)
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов для определения
гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (метод Drabkin) в клинико-диагностических и биохимических лабораториях.
Набор рассчитан на проведение 600 определений при расходе 5,0 мл рабочего раствора на один анализ.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид (цианметгемоглобин), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и измеряется фотометрически при длине волны 540 (500-560) нм.
СОСТАВ НАБОРА
1. Трансформирующий реагент — сухая смесь (натрий углекислый кислый, 1,0 г; калий железосинеродистый, 200 мг) — 3 упаковки.
2. Ацетонциангидрин — 3 ампулы (по 0,5 мл).
3. Калибровочный раствор гемоглобина с концентрацией 120 г/л — 1 флакон (2 мл).
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Линейная область определения концентрации гемоглобина — в диапазоне от 20 до 200 г/л, отклонение от линейности — не более 2%.
Чувствительность определения — не более 10 г/л.
Воспроизводимость: коэффициент вариации не более 2%.
Нормальные величины концентрации гемоглобина в крови составляют:
— у мужчин 130-160 г/л;
— у женщин 120-140 г/л.
Качество набора можно оценивать с использованием контрольных растворов гемоглобина отечественного или зарубежного производства.
Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон нормальных величин у обследуемого контингента.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
При работе с данным набором необходимо соблюдать правила техники безопасности, рекомендуемые при работе с кровью в соответствии с Инструкцией по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебных и профилактических учреждений, утвержденной Минздравом СССР от 17.01.91 г., и «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР».
При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять или передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.
В состав трансформирующего раствора входит ацетонциангидрин, ядовитое вещество. В случае попадания раствора на кожу и слизистые необходимо сразу же промыть пораженное место большим количеством проточной воды. Пипетирование per os категорически запрещается. При попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту.
Другие компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.
ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ
— Спектрофотометр, длина волны 540 нм, или фотоэлектроколориметр, длина волны 500-560 нм (зеленый светофильтр), кювета с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм;
— пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,02 и 5,0 мл;
— колба мерная вместимостью 1,0 л;
— пробирки вместимостью 5-10 мл;
— секундомер;
— вода дистиллированная;
— перчатки резиновые или пластиковые.
ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА
Трансформирующий раствор. Один пакет трансформирующего реагента и одну ампулу ацетонциангидрина количественно перенести в мерную колбу вместимостью 1,0 л, растворить в небольшом количестве дистиллированной воды и довести объем дистиллированной водой до метки.
Калибровочный раствор гемоглобина готов к применению.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
В пробирки внести по 5,0 мл трансформирующего раствора, добавить по 0,02 мл крови (разведение в 251 раз), тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре (+18-25° С) в течение 20 минут, после чего измерить величину оптической плотности опытных проб против холостой пробы (трансформирующего раствора) при длине волны 540 (500-560) нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.
Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывать так же, как и пробу цельной крови.
Окраска устойчива в течение 1 часа.
Концентрацию гемоглобина в крови рассчитать по формуле:
Eо
С = ——— х 120 ,
Eк
где: С — концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;
Eо — оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плотн.;
Eк — оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;
120 — концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2-8° С в течение всего срока годности. Допускается хранение наборов при температуре до +25° С не более 5 суток.
Срок годности набора — 2 года.
Трансформирующий раствор должен быть прозрачным, желтого цвета и может храниться в посуде из темного стекла при комнатной температуре не более 6 месяцев. При появлении осадка или при обесцвечивании раствор непригоден для употребления. Не замораживать!
Калибровочный раствор гемоглобина после вскрытия флакона может храниться в течение 6 месяцев, но не более срока годности набора, при хранении в укупоренном виде при температуре +2-8° С.
По вопросам, касающимся приобретения наборов и их качества, просим обращаться по адресу: 105173, г. Москва, ул. Западная, д. 2, стр. 1, ООО «Агат-Мед». Телефон для справок (495) 777-41-92.
Инструкция составлена: к.б.н. И.В. Смирновым — ст.н.с. Гематологического научного центра РАМН, к.б.н. Н.Н. Контугановым, В.В. Майоровой — сотрудниками ООО «Агат-Мед».
Источник
Унифицированный гемиглобинцианидный метод и
гематологического счетчика
Унифицированный гемиглобинцианидный метод (1974).
Принцип.
Гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием (красная кровяная соль); образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют колориметрически.
Реактивы.
- Трансформирующий раствор:
ацетонциангидрин 0,5 мг
калий железо-синеродистый 0,2 г
калий железо-синеродистый 0,2 г
натрия гидрокарбонат 0,2 г
натрия гидрокарбонат 0,2 г
дистиллированная вода 1 г
Раствор желтого цвета, прозрачный.
При обесцвечивании или появлении осадка непригоден.
Стабилен — в течение нескольких месяцев при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре
- Калибровочный раствор гемиглобинцианида. Можно использовать стандартный раствор фирмы «Имуна» (ЧССР) с концентрацией гемиглобинцианида 61,23 мг/100 мл и фирмы «Реанал» (ВНР) с концентрацией вещества 59,75 мг/100 мл. Это соответствует концентрации гемоглобина в крови 15,4 г/100 мл и 15 г/100 мл при разведении ее в 251 раз. Стандартные растворы хранят в холодильнике (в незамороженном виде) в защищенном от света месте.
Специальное оборудование.
Фотоэлектроколориметр (ФЭК-56М или другой).
Ход определения.
В пробирку к 5 мл трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл крови (разведение в 251 раз). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют стоять на 10 мин. Измеряют на фото-электроколориметре при длине волны 500- 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор). Измеряют при тех же условиях стандартный раствор.
Расчет содержания гемоглобина производят по калибровочному графику (см. ниже), построенному по стандартному раствору гемиглобинцианида, или по формуле:
где ЕОП — экстинкция опытной пробы; ЕСТ — экстинкция стандартного раствора; С- концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг%; К — коэффициент разведения крови; 0,001 — коэффициент для пересчета мг/100 мл в г/100 мл.
Измеряют против «холостой» пробы.
Определение содержания гемоглобина с помощью счетчика и гематологического автомата.
Принцип.
Гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием (красная кровяная соль); образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют колориметрически.
Оборудование.
Счетчик или гематологический автомат.
Ход исследования.
Соответствует инструкции, приложенной к прибору.
Литература.
- Кушаковский М. С. Клинические формы повреждения гемоглобина.- Л., 1968, с. 22;
- Грибова И. А. Гематологическая норма.- В кн.: Руководство по гематологии /Под ред. А. И. Воробьева, Ю. И. Лорие. М.: Медицина, 1979, с. 52.
Источник
3.2 Определение гемоглобина крови гемоглобинцианидным (фотоэлектроколориметрическим) методом
Приготовить опытную пробу. Для этого к 5 мл приготовленного трансформирующего раствора добавить 0,02 мл полученной из пальца цельной крови. Разведение крови в этом случае составит 251. Полученный раствор тщательно перемешать, выдержать 5-10 минут, а затем перенести в кювету фотоэлектроколориметра.
Приготовить кювету с трансформирующим раствором. Для этого отмерить 5 мл трансформирующего раствора и перенести его в аналогичную кювету (как для разбавленной крови).
Совместно с лаборантом произвести измерение согласно инструкции прибора. Измерения проводятся не менее 3 раз и затем вычислить среднюю арифметическую. Расчет содержания гемоглобина в исследуемой крови произвести по формуле:
где: Еоп ― экстинкция опытной пробы;
Ест ― экстинкция стандартного раствора (определяется однократно для одного набора из 200 проб);
С ― концентрация гемоглобинцианида (59,8 мг/%);
К ― степень разведения крови (в 251 раз).
В выводе содержание гемоглобина в исследуемой крови сравнить с нормой. Перевести количество гемоглобина в единицы СИ. Для этого полученные по формуле значения умножить на 10 и выразить результаты в г/л.
Гемоглобин: Хромопротеид — глобин + гем ( протопорфирин IX + железо)
Формы гемоглобина (в норме):
HbA 1 (нормальный Нb взрослого) — 96-98% (у взрослых)
HbA 2 (минорный Hb взрослого) — 2-3%
Hb F (фетальный Hb) — 1-2%
Повышение концентрации Hb: эритроцитозы, эритремия, обезвоживание, физическая нагрузка, гипоксия, курение
Снижение концентрации Hb: анемии, гипергидратация
Гемоглобин (HB) — основной дыхательный пигмент эритроцитов, относящийся к хромопротеидам и обеспечивающий ткани кислородом; состоит из белка — глобина и гема — соединения протопорфирина IХ с железом.
Снижение концентрации гемоглобина в крови является основным лабораторным симптомом анемии. При этом содержание гемоглобина варьирует в широких пределах в зависимости от формы анемии и ее степени. Следует, однако, иметь в виду, что диагностика анемии ни в коей мере не может быть проведена лишь на основании определения концентрации гемоглобина в крови. Это исследование устанавливает только факт наличия анемии. Для уточнения ее характера необходимо исследование количества эритроцитов, цветового показателя, других расчетных индексов эритроцитов, морфологии эритроцитов.
Повышение концентрации гемоглобина в крови может наблюдаться при миелопролиферативных заболеваниях и симптоматических эритроцитозах, сопутствующих различным состояниям. Среди миелопролиферативных заболеваний наиболее характерно повышение гемоглобина при эритремии. Симптоматические реактивные эритроцитозы могут быть абсолютными (обусловлены пролиферацией элементов эритропоэза) и относительными (гемоконцентрационные). Физиологическое увеличение содержания гемоглобина свойственно новорожденным.
3.3 Подсчет количества эритроцитов
Для работы необходимы: микроскоп, счетная камера Горяева, ме-ланжер для эритроцитов, 3% раствор хлорида натрия, покровные стекла, автоматическая пипетка, пробирки, одноразовый скарификатор, вата, ан-тисептическое средство. Объект исследования ― кровь человека.
Перед началом работы необходимо рассмотреть счетную камеру под микроскопом, найти малые квадратики и большие квадраты сетки (рису-нок 1). Камеру предварительно необходимо подготовить путем притирания покровного стекла к боковым выступающим граням камеры до появления цветных (ньютоновских) колец. В каплю свежей крови, полученной из пальца, погрузить кончик меланжера (с красной бусинкой в расширении) для эритроцитов и набрать кровь до метки 0,5, следя, чтобы в капилляр не попали пузырьки воздуха. Быстро, пока кровь не свернулась, перенести кончик меланжера в 3% раствор хлорида натрия и набрать его до метки 101, т.е. развести кровь в 200 раз. После этого взять заполненный мелан-жер (смеситель), зажать его концы 1 и 3 пальцами и в течение 1 мин встря-хивать. После тщательного перемешивания крови, удалив предварительно 1-2 капли, нанести небольшую капельку на сетку камеры.
Заполнив камеру, поместить ее под микроскоп и, если форменные эле-менты расположены равномерно (что является показателем хорошего пе-ремешивания крови), приступить к подсчету. Считать эритроциты удобнее при большом увеличении.
Необходимо подсчитать число эритроцитов в 5 больших квадратах, рас-положенных в разных местах сетки, например, по диагонали. Во избежание двухкратного подсчета клеток, лежащих на границе между малыми квадра-тиками, руководствоваться правилом Егорова, согласно которому, относя-щимися к данному квадратику считаются эритроциты, лежащие как внутри квадратика, так и на его левой и верхней границе. Эритроциты, лежащие на правой и нижней границе для данного квадратика не учитываются.
Формула для вычисления количества эритроцитов в 1 мм3 крови:
где: N ― искомое число эритроцитов;
А ― число эритроцитов в 80 маленьких квадратиках (или в 5 больших);
4000 ― множитель для получения содержания эритроцитов в одном мм3 крови;
200 ― степень разведения эритроцитов.
Повышение количества эритроцитов в крови — эритроцитоз (более 6,0*1012/л у мужчин и более 5,0*1012/л у женщин) — один из характерных лабораторных признаков эритремии. Эритроцитоз может быть абсолютным (увеличение массы циркулирующих эритроцитов вследствие усиления эритропоэза) и относительным (вследствие уменьшения объема циркулирующей крови). Основные причины:
Эритроцитозы наблюдаются при:
— Врожденные и приобретенные пороки сердца
— Легочное сердце
— Эмфизема легких
— Пребывание на значительных высотах
— Болезнь и синдром Кушинга
— Лечение стероидами
— Дегидратация
Соседние файлы в предмете Лабораторная диагностика
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
Источник
Инструкция по определению гемоглобина крови гемоглобинцианидным методом.
Принцип метода: гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин — гемиглобин, образующий с ацетонциангидрином окрашенный гемиглобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству гемоглобина.
Оборудование: ФЭК, гемоглобинометр или спектрофотометр.
Посуда: пипетки на 0,02 мл и 5,0 мл, пробирки, колба мерная на 1 л.
Реактивы:
1. Ацетонциангидрин (2 флакона по 0,5 мл — 0,47 г).
Калий железосинеродистый (2 флакона по 200 мг).
Натрий двууглекислый (2 флакона по 1 г).
Стандартный раствор гемиглобинцианида.
Концентрация гемиглобинцианида в стандартом растворе производства фирмы «Реанал» (Венгрия) — 59,75 мг%, что соответствует при разведении крови в 251 раз концентрации гемоглобина — 15 мг%. Этот стандартный раствор хранят в холодильнике при 40 С в защищенном от света месте (предохранять от замораживания).
Приготовление реактивов. Общее количество реактивов рассчитано на приготовление 2 л трансформирующего раствора (400 анализов). используя половину набора (по 1 флакону каждого реактива), можно приготовить 1 л трансформирующего раствора (200 анализов).
Трансформирующий раствор: содержимое трех флаконов 1,2 и 3 количественно переносят в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до 1 л. Раствор стабилен при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. При появлении осадка или при обесцвечивании раствор не пригоден для употребления.
Стандартный раствор гемиглобинцианида применяется в неразбавленном виде.
Ход определения. 0,02 мл крови приливают к 5 мл трансформирующего раствора в пробирке (разведение в 251 раз) и хорошо перемешивают. Через 10 мин измеряют на ФЭКе при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы (трансформирующего раствора), на спектрофотометре при длине волны 540 нм или на гемоглобинометре. Стандартный раствор измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу.
Расчет содержания производят по формуле или по калибровочному графику:
Hb (%)= | Е оп | х С х К х 0,001 |
Е ст |
где: Е оп — экстинкция опытной пробы
Е ст — экстинкция стандартной пробы
С — концентрация гемоглобина в стандартном растворе — 59,75 мг %
К — коэффициент разведения крови
0,001 — коэффициент для перечета количества гемоглобина
из мг% в г%
Приложение № 2.
Нормальные показатели клинического анализа крови.
Показатель | Единицы СИ | |
Показатель | Размерность | |
Гемоглобин М Ж | 130,0-160,0 120,0-140,0 | г/л |
Эритроциты М Ж | 4,0-5,0 3,9-4,7 | х 1012/л |
Цветовой показатель | 0,85-1,05 | |
Среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците | 30-35 | пг |
Ретикулоциты | 2-10 | ‰ |
Тромбоциты | 180,0-320,0 | х 109/л |
Лейкоциты | 4,0-9,0 | х 109/л |
Нейтрофилы: | ||
Миелоциты | — — | ‰ х 109/л |
Метамиелоциты | — — | ‰ х 109/л |
Палочкоядерные | 1-6 0,040-0,300 | ‰ х 109/л |
Сегментоядерные | 47-72 2,000-5,500 | ‰ х 109/л |
Эозинофилы | 0,5-5 0,020-0,300 | ‰ х 109/л |
Базофилы | 0-1 0-0,065 | ‰ х 109/л |
Лимфоциты | 19-37 1,200-3,000 | ‰ х 109/л |
Моноциты | 3-11 0,090-0,600 | ‰ х 109/л |
Плазматические клетки | — — | ‰ х 109/л |
Скорость (реакция) М оседания эритроцитов Ж | 2-10 2-14 | мм/ч |
Приложение № 3.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
- #
Источник