Холестерин общий набор реактивов

Холестерин может быть одновременно и другом, и врагом человека. Пока его уровень не превышает допустимой нормы, он первый помощник для организма. Но как только показатели станут выше, происходит совершенно обратное. Чтобы не допустить критической ситуации, следует постоянно контролировать уровень общего холестерина, а также количество ЛПНП в нем. Как можно провести лабораторное исследование? Поможет в этом набор для определения общего холестерина.

Методы определения

Естественно, на дому, не имея лабораторного оборудования, нельзя методом химического исследования крови установить уровень холестерина. Но можно купить набор реагентов для определения холестерина реактивами. Но есть другие способы определения концентрации этого вещества. На сегодняшний день используются три основных:

• Новохол;
• Илька;
• Златкиса-Зака.

Ни один из них не является абсолютно точным и, как правило, дает погрешности в ту или иную сторону.

Метод Златкиса-Зака

С помощью этой методики можно достаточно достоверно установить концентрацию общего холестерина в крови, так как в реакцию со свободными молекулами этого вещества вступают реагенты. Используется такой их набор:

• хлорное железо;
• уксусная и серная кислоты;
• фосфатная кислота.

Сначала соединяются три кислоты, потом к ним прибавляется выделенная сыворотка крови, после этого производится окисление с помощью железа. Исследуемая жидкость в ходе реакции будет менять свой цвет от светло-алого до насыщенно-бордового. По этому методу норма холестерина в крови должна оставаться в пределах от 3,2 ммоль/литр до 6,4 ммоль/литр.

Метод Илька

При этом исследовании определения холестерина используются такие реагенты:

• ледяная уксусная кислота;
• уксусный ангидрид;
• концентрат серной кислоты.

Все три вещества нужно соединить в строгих пропорциях, чтобы образовалась очень кислая среда. Затем ее смешивают с сывороткой крови, ее сначала нужно соединить с этиловым спиртом и хлороформом. Этот метод считается опасным из-за использования сильно концентрированных кислот, поэтому использовать его может только профессиональный химик. По этому методу нормой холестерина является 4,6–6,5 ммоль/литр. В ходе реакции биосырье окрашивается в различные оттенки зеленого, иногда становится синим или красным – это обусловлено температурой и количеством билирубина в крови.

Метод по набору Новохол

Этот метод самый безопасный из всех перечисленных и его допустимо применять в домашних условиях. Набор реагентов состоит из различных ферментов и аминопирина. Как основное сырье для исследования можно применять плазму крови, желчь, спинномозговую жидкость или слюну. Сначала в жидкость вводят холестероэстеразу, которая разрушает связи холестерина с молекулами других веществ и преобразует его в свободный. Затем добавляется холестеролоксидаза. В ходе этой реакции холестерин окисляется и преобразуется в холестинон, выделив перекись водорода. В завершение происходит окисление аминопирина пероксидазой.

Цвет жидкости в ходе реакций может измениться от светло-розового до темно-малинового.

На показатели может повлиять наличие остатков гормональных препаратов в крови человека, его возраст, физическая активность. Следует учитывать, что показатели по этим методам не являются абсолютно точными. Поставить диагноз может всегда только врач.

Определение свободного холестерина

Иногда необходимо установить только концентрацию свободного холестерина – главного провокатора атеросклероза и сердечных заболеваний. Для выполнения этого исследования вначале нужно выделить холестерин из плазмы крови с помощью этилового спирта. Затем вытяжку холестерина с помощью различных реагентов преобразуют в осадок. Чтобы установить уровень ЛПНП, нужно растворить выделенный осадок с помощью специфических реагентов.

Получить точные показатели вредного или общего холестерина в крови без полноценного биохимического анализа в условиях лаборатории достаточно сложно, так как потребуется специальное оборудование и реагенты, приобрести которые не всегда возможно. Кроме того, сам человек должен разбираться в химии и иметь определенные навыки лаборанта. К сожалению, уровень холестерина нельзя определить без реагентов, как уровень глюкозы в плазме крови, посредством несложного и безопасного прибора в домашних условиях. Но это не является поводом не контролировать концентрацию ЛПНП, если того требует диагноз. Когда требуются точные показатели, то лучше всего будет обратиться в медицинское учреждение и сдать кровь для проведения развернутого биохимического исследования в условиях лаборатории.

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для определения концентрации общего холестерина колориметрическим энзиматическим методом

Утверждена

Приказом Росдравнадзора

От 24.12.2007 г. № 5116-Пр/07

НАЗНАЧЕНИЕ 

Набор предназначен для количественного определения общего холестерина в плазме и сыворотке крови человека энзиматическим колориметрическим методом в клинико-диагностических и биохимических лабораториях и научно-исследовательской практике.

Набор рассчитан на проведение  200 определений при расходе 1,0 мл рабочего реагента на один анализ.

ПРИНЦИП МЕТОДА

При гидролизе эфиров холестерина холестеринэстеразой образуется свободный холестерин. Образовавшийся свободный холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестериноксидазы с образованием эквимолярного количество перекиси водорода: последний под действием пероксидазы окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного соединения. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в анализируемом образце и измеряется фотометрически при длине волны 500 (490–540) нм.

 СОСТАВ НАБОРА

1. Ферментно-хромогенная смесь (холестеролэстераза, холестеролоксидаза, пероксидаза, аминоантипирин, гидроксибензол сульфонат натрия, холат натрия, фосфатный буфер) – 10 таблеток;

2. Детергент (10% р-р тритон Х-100), 1 мл – 1 флакон;

3. Калибратор (калибровочный раствор холестерина, 5,17 ммоль/л (200 мг/дл), 1 мл – 1 флакон.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

Линейная область определения концентрации холестерина – в диапазоне концентраций от 1,0 до 15,0 ммоль/л, отклонение от линейности – не более 5%.

Чувствительность определения – не более 0,5 ммоль/л.

Воспроизводимость: коэффициент вариации не более 5%.

Стабильность окраски не менее 3 часа.

Для проверки правильности определений рекомендуется использовать отечественные или зарубежные контрольные сыворотки, аттестованные данным методом.

Нормальные величины содержания холестерина в сыворотке и плазме крови человека составляют: 3,5–6,9 ммоль/л.

Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон значений нормальных величин для обследуемого контингента.

Ферментно-хромогенная смесь содержит токсичные компоненты. В случае попадания ее раствора на кожу и (или) слизистые необходимо сразу же промыть пораженное место большим количеством воды. Пипетирование per os категорически запрещается. Другие компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

При работе с сывороткой или плазмой крови необходимо соблюдать правила техники безопасности принятые в лаборатории, т.к. образцы человеческой крови следует рассматривать как потенциально инфицированные.

ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ ОТХОДОВ

Проводить в соответствии с местными правилами.

ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ

– Спектрофотометр, длина волны 500 нм, или фотоэлектроколориметр, (490–540) нм, с толщиной поглощающего свет слоя 10 или 5 мм;

– пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,025–2,0 мл;

– флаконы или пробирки вместимостью 5–10 мл;

– секундомер;

– колбы мерные вместимостью 100 или 200 мл;

– пробирки стеклянные вместимостью 10 мл;

– термостат, поддерживающий температуру +37±1° С;

– вода дистиллированная.

АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

Негемолизированная сыворотка крови. Гепаринизированная или ЭДТА плазма. Сыворотку и плазму крови получают обычным образом.

Стабильность образцов:

1 день при 20–25° С

3 дня при 4–8° С

3 месяца         при -20° С.

ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

Приготовление рабочего реагента: 10 таблеток ферментно-хромогенной смеси поместить в мерную колбу вместимостью 200 мл. Добавить 150 мл дистиллированной воды и 0,4 мл раствора детергента. Тщательно перемешать до полного растворения таблеток, избегая вспенивания раствора. Довести объем дистиллированной водой до метки. Допускается наличие мелких нерастворенных частиц. В случае их появления, раствору дать отстояться и его аккуратно перелить в чистую емкость. Перенести рабочий реагент в посуду из темного стекла.

Полученный рабочий реагент можно хранить в темном месте в плотно укупоренной посуде при температуре (+2–8° С) не более 7 дней.

Внести в пробирки анализируемые образцы сыворотки или плазмы крови и реагенты по следующей схеме (при использовании анализаторов или кювет с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм):

*При работе на фотоколориметре с кюветой с длиной оптического пути 5 мм или 3 мм отношение сыворотки к рабочему реагенту должно составляет 1:100.  Для более точного дозирование сыворотки и калибратора рекомендуется использовать обратный метод пипетирования для  ручных одноканальных дозаторов.

Пробы тщательно перемешать и инкубировать в течение 25 мин при комнатной температуре (+18–25° С) или в течение 15 мин при температуре +37° С.

После окончания инкубации измерить величину оптической плотности опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 500 (490–540) нм.

Окраска проб стабильна в течение 3 часов после окончания инкубации при условии предохранения от прямого воздействия солнечных лучей.

Расчет концентрации холестерина в анализируемых пробах провести по формуле:

  Eо

С = ———   х  5,17 ,

  Eк

где: С  – концентрация холестерина, ммоль/л;

Eо – оптические плотности опытной пробы, ед.опт.плотн.;

Eк – оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;

5,17  – концентрация холестерина в калибровочной пробе, ммоль/л.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА 

Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2–8° С в течение всего срока годности. Допускается хранение наборов при температуре +25° С не более 5 суток.

Срок годности набора – 12 месяцев.

Рабочий реагент можно хранить при температуре +2–8° С в посуде из темного стекла не более 7 дней при условии достаточной герметизации.

Калибратор после вскрытия флакона плотно укупоренный можно хранить при температуре +2–8° С в темном месте не более 2 месяцев.

По вопросам, касающимся приобретения наборов и их качества, просим обращаться по адресу: 105173, г. Москва, ул. Западная, д. 2, стр. 1, ООО «Агат–Мед». Телефон для справок: (495) 777-41-92. 

Назад к списку инструкций