Методы исследования гемоглобина гемоглобинцианидным методом

Руководитель Департамента государственного контроля

качества, эффективности, безопасности лекарственных

средств и медицинской техники МЗ РФ

Р.У. Хабриев

17.06.2000 г.

Рекомендована к утверждению

Комиссией по лабораторным реагентам

 Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ 

(протокол № 1 от 31.01.2000 г.) 

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для определения

гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом

НАЗНАЧЕНИЕ 

Набор предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (метод Drabkin) в клинико-диагностических и биохимических лабораториях. 

Набор рассчитан на проведение 600 определений при расходе 5,0 мл рабочего раствора на один анализ.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид (цианметгемоглобин), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и измеряется фотометрически при длине волны 540 (500–560) нм.

СОСТАВ НАБОРА

1. Трансформирующий реагент – сухая смесь (натрий углекислый кислый, 1,0 г; калий железосинеродистый, 200 мг) – 3 упаковки.

2. Ацетонциангидрин – 3 ампулы (по 0,5 мл).

3. Калибровочный раствор гемоглобина с концентрацией 120 г/л – 1 флакон (2 мл).

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

Линейная область определения концентрации гемоглобина – в диапазоне от 20 до 200 г/л, отклонение от линейности – не более 2%.

Чувствительность определения – не более 10 г/л.

Воспроизводимость: коэффициент вариации не более 2%.

Нормальные величины концентрации гемоглобина в крови составляют:

     – у мужчин 130–160 г/л;

     – у женщин 120–140 г/л.

Качество набора можно оценивать с использованием контрольных растворов гемоглобина отечественного или зарубежного производства. 

Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон нормальных величин у обследуемого контингента.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

При работе с данным набором необходимо соблюдать правила техники безопасности, рекомендуемые при работе с кровью в соответствии с Инструкцией по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебных и профилактических учреждений, утвержденной Минздравом СССР от 17.01.91 г., и «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР». 

 При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять или передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.

В состав трансформирующего раствора входит ацетонциангидрин, ядовитое вещество. В случае попадания раствора на кожу и слизистые необходимо сразу же промыть пораженное место большим количеством проточной воды. Пипетирование per os категорически запрещается. При попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту. 

Другие компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

 ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ

– Спектрофотометр, длина волны 540 нм, или фотоэлектроколориметр, длина волны 500–560 нм (зеленый светофильтр), кювета с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм;

– пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,02 и 5,0 мл;

– колба мерная вместимостью 1,0 л;

– пробирки вместимостью 5–10 мл;

– секундомер;

– вода дистиллированная;

– перчатки резиновые или пластиковые.

ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

Трансформирующий раствор. Один пакет трансформирующего реагента и одну ампулу ацетонциангидрина количественно перенести в мерную колбу вместимостью 1,0 л, растворить в небольшом количестве дистиллированной воды и довести объем дистиллированной водой до метки.

Калибровочный раствор гемоглобина готов к применению.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

В пробирки внести по 5,0 мл трансформирующего раствора, добавить по 0,02 мл крови (разведение в 251 раз), тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре (+18–25° С) в течение 20 минут, после чего измерить величину оптической плотности опытных проб против холостой пробы (трансформирующего раствора) при длине волны 540 (500–560) нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. 

Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывать так же, как и пробу цельной крови.

Окраска устойчива в течение 1 часа.

Концентрацию гемоглобина в крови рассчитать по формуле:

              Eо

     С = ———  х 120 ,

              Eк

где: С – концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;

       Eо – оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плотн.;

       Eк – оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;

       120 – концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА 

Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2–8° С в течение всего срока годности. Допускается хранение  наборов при температуре до +25° С не более 5 суток. 

Срок годности набора – 2 года.

Трансформирующий раствор должен  быть прозрачным, желтого цвета и может храниться в посуде из темного стекла при комнатной температуре не более 6 месяцев. При появлении осадка или при обесцвечивании раствор непригоден для употребления. Не замораживать!

Калибровочный раствор гемоглобина после вскрытия флакона может храниться в течение 6 месяцев, но не более срока годности набора, при хранении в укупоренном виде при температуре +2–8° С.

По вопросам, касающимся приобретения наборов и их качества, просим обращаться по адресу: 105173, г. Москва, ул. Западная, д. 2, стр. 1, ООО «Агат–Мед». Телефон для справок (495) 777-41-92.

Инструкция составлена:  к.б.н. И.В. Смирновым – ст.н.с. Гематологического научного центра РАМН, к.б.н. Н.Н. Контугановым, В.В. Майоровой – сотрудниками ООО «Агат–Мед».

Соседние файлы в предмете Лабораторная диагностика

• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #

В настоящее время в клинико-диагностической практике широко применяются колориметрические циангемоглобиновые методы, характеризующиеся точностью и технической простотой. В большинстве стран эти методы приняты как стандартные и рекомендованы комитетом по стандартизации Европейского и Международного общества по гематологии (Deutscher Normenausschuss, Normentwurf DIN 58931, 1964; Boroviczeny К. G., 1964).

В России основным методом количественного определения гемоглобина в клинической практике является унифицированный гемоглобинцианидный метод. Преимущества этого метода заключаются в использовании надежных и стабильных циангемоглобиновых стандартов, устойчивого трансформирующего раствора, что позволяет измерять все клинически значимые фракции гемоглобина. Точность гемоглобинцианидного метода определяется тем, что в его основе лежит превращение всех форм гемоглобина в низкоспиновую окисленную форму — циангемоглобин.

Гемоглобинцианидный метод, разработанный в 1936 г. Драб- киным, был одобрен Международным комитетом по стандартизации в гематологии (ICSH) в 1963 г.

Принцип гемоглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну — гемоглобинцианид. Одним из преимуществ метода кроме простоты и точности является тот факт, что HbCN — стабильное производное гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbCN.

Суть метода: кровь смешивают с реактивом Драбкина: KCN — 0,05 г, K3[Fe(CN)6] — 0,2 г, дистиллированной воды — до 1 л. Под влиянием железосинеродистого калия (красной кровяной соли) гемоглобин окисляется в метгемоглобин, который под действием ацетонциангидрина затем превращается в циангемоглобин (гемоглобинцианид). Циангемоглобин имеет красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе. Окрашенный цианметгемоглобин определяют колориметрически. Через 20 мин, необходимых для полного превращения гемоглобина в циангемоглобин, измеряют экстинкцию при длине волны 540 нм и толщине слоя 1 см против дистиллированной воды на спектрофотометре СФ-4 или на ФЭК-М или подобных ему фотоэлектроколориметрах.

Преимущества этого метода заключаются в использовании надежных и стабильных циангемоглобиновых стандартов, устойчивого трансформирующего раствора, что позволяет измерять все клинически значимые фракции гемоглобина.

Существуют и селективные методы колориметрии отдельных типов гемоглобина (методы Зингера, Ветке), но селективность их относительна: эти методы регистрируют щелочеустойчивую фракцию гемоглобина, к которой можно отнести как фетальный, так и примитивный (эмбриональный) типы гемоглобина. Метод Ветке, по сравнению с методом Зингера, обладает гораздо большей разрешающей способностью и отличается простотой.

Метод основан на резистентности фетального гемоглобина (и некоторых других типов гемоглобина) к денатурирующему действию щелочей. HbF в 155 раз более устойчив к 1/12 раствору натриевой щелочи, чем нормальный гемоглобин. Вначале гемоглобин превращают в циангемоглобин, что не мешает определению. Из гемолизата получают циангемоглобиновый раствор путем прибавления K3[Fe(CN)6] — KCN раствора (0,2 г K3[Fe(CN)6] + 0,2 г KCN до 1000 мл дистиллированной воды). Через 30 мин 2,8 мл этого циангемоглобинового раствора смешивают с 0,2 мл 1,2 М раствора NaOH. Через 2 мин прибавляют 2 мл насыщенного раствора (NH4)2S04.

Коагулированный денатурированный НЬА осаждают центрифугированием. HbF и другие щелочеустойчивые формы гемоглобина остаются в растворе. Концентрацию оставшегося в супернатанте гемоглобина определяют на спектрофотометре, отсчитывая экстинкцию фильтрата (ЕА) против воды при длине волны 540 нм.