Методы лабораторного исследования гемоглобина

ГЕМОГЛОБИНОМЕТРИЯ

ГЕМОГЛОБИНОМЕТРИЯ (гемоглобин + греч, metreo измерять) — определение количества (концентрации) гемоглобина крови. В клин, лабораторной практике Г. проводится при исследовании больных, проф. осмотрах, экспертизе.

Существуют три основные группы методов Г.: колориметрические, газометрические и по содержанию железа в крови. Кроме того, имеется полуколичественный метод определения концентрации гемоглобина по удельному весу крови.

Колориметрические методы определения гемоглобина, разработанные в своей основе Велькером (H. Welcker), У. Говерсом, Г. Сали в 19 в., основаны на способности гемоглобина крови давать при хим. реакциях цветные производные — оксигемоглобин, карбоксигемоглобин, метгемоглобин, гемиглобинцианид, солянокислый гемин и т. д.

Гемометр ГС-3: 1 — градуированная пробирка, верхняя часть которой выступает над гемометром, градуированная часть видна в средней прорези; 2 — запаянные пробирки со стандартным окрашенным раствором видны в боковых прорезях; 3 — штатив с тремя прорезями.

Существуют различные конструкции аппаратов, применяемых при этом методе Г.: от визуальных, типа компараторов и колориметров, до фотоэлектрометрических колориметров и фотометров (см. Колориметрия, Фотометрия, Спектрофотометрия). Ряд гемометров (Флейшля-Мишера, Бюркера, Аутенрита, «Мигос», «Цейсс-Икон», «Сикка») устарели. Для широкой практической работы в СССР выпускают гемометры ГС-З (гемометр Сали, вариант № 3; рис.), представляющие небольшой штатив из темной пластмассы с тремя смотровыми окошками. К прибору приложены пипетки, среди них точно отградуированная пипетка на 20 мкл для забора крови. В крайних гнездах стойки расположены запаянные пробирки со стандартным р-ром. В среднее гнездо штатива вставляется градуированная пробирка с пробой крови, разведенной децинормальной соляной к-той. Градуированная пробирка имеет две контрольные круговые метки: нижняя соответствует 0,2 мл, а верхняя — 2 мл. Шкала пробирки градуирована в грамм-процентах.

Первоначально количество гемоглобина было принято обозначать в так наз. единицах Сали, за 80 ед. была принята кровь с содержанием 5 ООО ООО эритроцитов в 1 мкл. Затем эти единицы стали выражать в процентах к норме. Но авторы разных типов гемометров принимали за 100% разные концентрации гемоглобина: от 14 до 17,3 г%. Поэтому величины процентного содержания гемоглобина были несопоставимыми. Осуществляется переход на выражение концентрации гемоглобина в грамм-процентах (г%) — количество гемоглобина в граммах в 100 мл крови. В СССР за 100% принято 16,7 г%. Т. о., 1 г% соответствует в процентном исчислении 6%.

Гемометры типа Сали требуют регулярной стандартизации и проверки, поскольку цвет стандартных р-ров со временем изменяется. Кроме того, оценка результатов отличается субъективностью, у разных исследователей расхождение показателей может достигать 15% и больше у одного и того же исследуемого.

Определение концентрации гемоглобина гемометром ГС-3 (Сали). Необходимые реактивы: децинормальный р-р соляной к-ты и дист, вода. Ход определения: капиллярной пипеткой гемометра — пипеткой Сали — насасывают выступающую из прокола кожи кровь до отметки 0,02 (20 мкл) и осторожно (чтобы не вспенить смесь) выдувают в градуированную пробирку гемометра с децинормальным р-ром соляной к-ты, предварительно налитой до нижней круговой метки; капилляр трижды осторожно промывают в смеси, содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой и пробирку вставляют в среднее гнездо гемометра между эталонами; выжидают 5 мин. При реакции гемоглобина с децинормальным р-ром соляной к-ты образуется солянокислый гемин, который имеет бурое окрашивание. Под визуальным контролем в пробирку добавляют дист, воду (пипеткой по каплям), перемешивая р-р стеклянной палочкой и сравнивая окраску р-ра солянокислого гемина в средней пробирке с цветом стандарта в ампулах. Когда окрашивание испытуемого р-ра совпадает по цвету со стандартами, пробирку извлекают из гнезда прибора, определяют по шкале пробирки уровень жидкости (по нижнему краю мениска р-ра), что соответствует концентрации гемоглобина.

Определение концентрации гемоглобина фотоэлектрическим эритрогемометром (одновременно можно подсчитать количество эритроцитов). Метод основан на превращении гемоглобина крови в оксигемоглобин. Реактив для раз-, ведения крови содержит 1 г карбоната натрия в 1 л дист. воды. Ход определения: в пробирку с 5 мл реактива пипеткой от гемометра Сали вносят 40 мкл крови, осторожно перемешивают и выливают в кювету эритрогемометра. Измеряют степень поглощения р-ром гемоглобина волн определенной длины синей части спектра в соответствии с руководством к пользованию прибором. Шкала эритрогемометра составлена в грамм-процентах.

Определение концентрации гемоглобина фотоэлектроколориметром ФЭК-М или ФЭК-56 по Г. В. Дервизу и А. И. Воробьеву основано на превращении гемоглобина крови в оксигемоглобин, образующийся при гемолизе эритроцитов р-ром аммиака. Реактив: 0,024 н. (т. е. 0,04%) р-р аммиака. Ход определения: в пробирку с 4 мл 0,04% р-ра аммиака пипеткой Сали вносят 20 мкл крови с обычным трехкратным ополаскиванием ее. Пробирку встряхивают и выливают в кювету. Определение гемоглобина на ФЭК-М проводится при зеленом фильтре и в соответствии с правилами пользования прибором.

По величине экстинции (показатель оптической плотности) находят соответствующее значение концентрации гемоглобина в грамм-процентах. Калибровочная кривая составляется для каждого данного аппарата по стандартному р-ру гемоглобина.

Определение концентрации гемоглобина в колориметре «Линсон Юниор», приложенном к целлоскопу фирмы «АВ Ljung berd» (Швеция): гемоглобин из эритроцитов выделяется при гемолизе р-ром сапонина. Реактивы: р-р для разведения крови содержит 0,9% р-р хлорида натрия — 950 мл, фосфатный буфер М/15 pH 7,55 — 45 мл, 35% р-р нейтрального формалина — 5 мл; 2% р-р сапонина в 0,9% р-ре хлорида натрия. Р-р хранится в холодильнике не более двух дней.

Ход определения: в пробирку с 4 мл р-ра для разведения крови вносят 20 мкл крови, затем добавляют 0,1 мл р-ра сапонина, перемешивают, выливают в кювету прибора и фотометрируют. К прибору прилагается таблица, по к-рой показатель шкалы оптической плотности переводится в грамм-проценты.

Фотоэлектрические гемометры ГФ-1, ГФ-2 и ГФ-3 с проточными кюветами предназначены для массовых исследований в условиях лаборатории. Шкалы этих аппаратов калиброваны как для оксигемоглобинового, так и для гемиглобинцианидного метода.

Применение гемиглобинцианидного метода основано на превращении гемоглобина крови в гемиглобинцианид при добавлении к крови трансформирующего реактива, содержащего цианистые соединения. Реактив: 200 мг железосинеродистого калия, 50 мг цианида калия, 140 мг монофосфата калия и 0,5 мл Sterox Se (концентрированного) растворяют в дист, воде и доводят объем р-ра до 1 л: pH по pH-метру должен быть 7,0-7,4. Реактив длительное время может сохраняться в бутыли из темного стекла, желательно в холодильнике (при t° 4°). Можно применить и реактив, предложенный Драбкиным: железосинеродистый калий (красная кровяная соль) — 0,2 г, цианид калия — 0,05 г, бикарбонат натрия — 1 г, дист, вода — до 1 л.

Ход определения: в пробирку с 5 мл реактива вносят 20 мкл крови, хорошо смешивают и оставляют для образования гемиглобинцианида на 2-4 мин. (при работе с реактивом Драбкина, который имеет щелочную реакцию pH 8,6 и поэтому образование гемиглобинцианида идет медленно,- на 20 мин.). Затем переливают в кювету и определяют концентрацию гемоглобина на калиброванном фотоэлектроколориметре или спектрофотометре.

Применение р-ров цианметгемоглобина в колориметрическом Методе Г. признано Международным комитетом по стандартизации в гематологии наиболее точным и объективным методом Г. Указанный комитет выпускает эталонный долгохранящийся р-р гемиглобинцианида для стандартизации и постоянной проверки и калибровки гемометров.

В СССР выпускаются стандартные (эталонные) р-ры циансодержащего трансформирующего реактива по Драбкину. Раствор гемиглобин-цианида утвержден как унифицированный стандарт для определения концентрации гемоглобина в клинико-диагностических лабораториях.

Газометрические методы основаны на использовании свойства гемоглобина присоединять кислород или окись углерода в строго определенных объемах. Используют приборы Ван-Слайка, Баркрофта (см. Ван-Слайка методы).

Расчет концентрации гемоглобина по количеству железа в пробе крови. Количество железа в четырех геминовых группах молекулы гемоглобина составляет 0,347%, следовательно, по количеству железа можно установить содержание гемоглобина. Эта группа методов в клинических лабораториях не применяется.

Полуколичественный метод (купросульфатный) определения концентрации гемоглобина по удельному весу крови был разработан Ван-Слайком (D. D. Van Slyke). Сотрудники ЦОЛИПК применили этот метод для быстрого отбора доноров. Принцип метода основан на том, что удельный вес реактива выбирают соответственно пограничной концентрации гемоглобина, допустимой для отбора доноров: в зависимости от удельного веса капля крови всплывает или опускается на дно сосуда с реактивом, что свидетельствует об уменьшенной или нормальной концентрации гемоглобина в крови. Приготовление реактива: на 2 л дист, воды берут 500 г сульфата меди (чистый, для анализа); полученный р-р фильтруют через бумажный складчатый фильтр и затем, прибавляя небольшие количества дист, воды, доводят до удельного веса 1,052 под контролем урометра, поддерживая температуру р-ра и воды на уровне 20°. Ход определения: в стаканчик наливают раствор сульфата меди высотой 5 см. Чистой и сухой пастеровской пипеткой набирают кровь и с высоты 1 см над уровнем р-ра выпускают каплю в стаканчик. Сначала капля крови опускается на глубину 2-3 см. Если через 10-15 сек. она всплывает или остается взвешенной в толще р-ра, то концентрация гемоглобина крови ниже 12 г%, если погружается на дно р-ра,- выше 12 г%. Между последующими определениями должно пройти не менее 1 мин., в течение к-рой все капли оседают на дно.

Нормальное содержание гемоглобина в крови: для женщин среднее значение 13,0 г%, колебания 12,0-14.0 г%; для мужчин среднее значение 14,5 г%, колебания 13,0-16.0 г%.

Библиография: Дeрвиз Г. В. Применение фотоэлектроколориметров (ФЭК-М и ФЭК-56) для цианметгемоглобинового метода’ определения концентрации гемоглобина в крови, Лаборат, дело, № 2, с, 67, 1973, библиогр.; К о р ж у e в П; А. Гемоглобин, М., 1964, библиогр.; Кушаковский М. С. Клинические формы повреждения гемоглобина, с. 25, Л., 1968; Соколов В. В. и Грибова И. А. Показатели периферической крови у здоровых людей, Лаборат, дело, № 5, с. 259, 1972; Справочник по клиническим лабораторным методам исследования, под ред. Е. А. Кост, с. 5, М., 1975; Унифицированные методы клинических лабораторных исследований, под ред. В. В. Меншикова, в. 6, с. 103, М., 1974, библиогр.; Ярустовская JI. Э., Реутова М. Б. иЛипацА. А. Показатели периферической крови у здоровых людей, Пробл, гематол. и* перелив, крови, т. 14, № 2, с. 29, 1969, библиогр.; Antonini E. a. Brunori М. Hemoglobin, Ann. Rev. Biochem., v. 39, p. 977, 1970; S t o b b e H. Untersuchun-gen von Blut und Knochenmark, S. 177, B., 1968; Sunderman F. W. us of clinical haemoglobinometry in the United es, в кн.: Standardization, documentation a. normal values in haematology, ed. by C. G. de Boroviczeny, p. 25, Basel — N. Y., 1965.

В. А. Германов, Г. В. Дервиз.

Источник