Реакция либермана бурхарда на холестерин
Содержание статьи
Лабораторная работа 12. Метод Либермана-Бурхарда
Одним из первых колориметрических методов, нашедших широкое применение для определения стеринов, является метод Либермана–Бурхарда. Метод сводится к измерению интенсивности зеленовато-голубой окраски раствора стеринов, возникающей после обработки его смесью уксусного ангидрида и серной кислоты (соотношение от 20:1 до 5:1).
Часто используют всевозможные модифицированные реактивы Либермана–Бурхарда. Например, один объем концентрированной серной кислоты смешивают с 20 объемами уксусного ангидрида, охлажденного до температуры ниже 10 оС. Полученную смесь охлаждают в течение 9 минут и добавляют 10 объемов ледяной уксусной кислоты. Данный реактив пригоден для работы в течение одного часа.
Реактив, приготовленный на основе 2%-го раствора сульфата натрия и смеси уксусного ангидрида, уксусной и серной кислот в соотношении 6:3:1 (по объему) имеет срок хранения в холодильнике один месяц.
Схема реакции Либермана–Бурхарда следующая. На первой стадии под действием серной кислоты протекает реакция дегидратации с образованием 3,5 диенов, которые затем в процессе окислительной ди- и тримеризации образуют высокосопряженные производные, растворимые в серной кислоте.
Серная кислота на первом этапе выступает в роли дегидратирующего агента, а в дальнейшем участвует в образовании сульфокислот холестерола, обуславливающих в конечном итоге зеленый цвет раствора. Вышеназванная реакция характерна не только для стеринов и их эфиров, но и для других соединений, например холевой кислоты. Максимум поглощения окрашенных соединений лежит при 610 и 410 нм. Из-за неустойчивости окраски полученных соединений необходимо строго выдерживать время фотометрирования. Кроме того, реакция чувствительна к изменению температуры, поэтому необходимо выдерживать температурный режим реактива после добавления серной кислоты.
Метод Либермана-Бурхарда дает завышенные результаты при определении эфиросвязанных стеринов. Интенсивность окраски эфиров холестерола выше, чем у свободного холестерола, что снижает надежность результатов анализа.
Определение холестерола
Метод Либермана-Бурхарда используется главным образом для количественного определения холестерола.
Ход анализа. В фотометрическую кювету внести пипеткой 4,2 мл реактива Либермана–Бурхарда и медленно по стенке добавить 0,1 мл раствора неомыляемых веществ в хлороформе (содержание свободного холестероола 1–3 мг/мл). Раствор перемешать, термостатировать при 37 оС в течение 30 минут при комнатной температуре. При этом развивается зеленое окрашивание. Полученный раствор зеленого цвета колориметрировать при длине волны 620 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать смесь из 4,2 мл реактива Либермана-Бурхарда и 0,1 мл хлороформа. Концентрацию исследуемой пробы определить по калибровочному графику. Концентрацию холестерола (МС, мг%) рассчитать по формуле:
MC=CKV×100,
где СК – концентрация холестерола в исследуемой пробе, найденная по калибровочному графику, мг/мл;
V – объем пробы, взятой на анализ, 0,1 мл;
100 – коэффициент пересчета в проценты.
Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора холестерола (1,8 мг/мл) в градуированных пробирках приготовить пять калибровочных растворов по схеме, приведенной в табл. 1.4.8.
Таблица 1.4.8. Схема приготовления калибровочных растворов холестерола
Номер калибровочного раствора | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Стандартный раствор холестерола, мл | 0,05 | 0,10 | 0,15 | 0,20 | 0,25 |
Реактив Либермана-Бурхарда, мл | 4,25 | 4,20 | 4,15 | 4,10 | 4,05 |
Масса холестерола, мг | 0,09 | 0,18 | 0,27 | 0,36 | 0,45 |
Объем растворов довести до 4,3 мл с помощью реактива Либермана-Бухарда. Содержимое пробирок аккуратно перемешать, термостатировать при температуре 37 оС и через 30 минут колориметрировать при длине волны 620 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать смесь из 4,2 мл реактива Либермана-Бурхарда и 0,1 мл хлороформа.
Определение стеринов
Метод Либермана-Бурхарда применим для количественного определения стеринов, имеющих сопряженные кратные связи в 5 и 7 положениях (эргостерола и 7 – дегидрохолестерола). Интенсивность окраски D5, 7-оксистеринов почти в четыре раза выше интенсивности окраски холестерола, при этом окраска развивается почти мгновенно, тогда как в аналогичных экспериментальных условиях для развития окраски в присутствии холестерола требуется полчаса.
Это свойство используется для количественно определения 7-дегидрохолестерола в присутствии холестерола путем измерения поглощения в области 620 нм через 1,5 минуты и 30 минут с момента начала цветной реакции.
Ход анализа. В пробирку с пришлифованной пробкой внести пипеткой 1 мл экстракта неомыляемых веществ в хлороформе. К экстракту добавить 0,7 мл уксусного ангидрида и 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Раствор перемешать, довести объем до 5 мл хлороформом и термостатировать при 37 оС в течение 1,5 минуты для развития окраски. Полученный раствор зеленого цвета колориметрировать при длине волны 620 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм.
В качестве раствора сравнения использовать смесь из 0,7 мл уксусного ангидрида, 0,1 мл концентрированной серной кислоты и 4,2 мл хлороформа. Концентрацию стеринов в исследуемой пробе определить по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Из стандартного (0,1 мг/мл) эргостерола в хлороформе приготовить калибровочные растворы с заданной концентрацией по схеме, приведенной в табл. 1.4.9.
Таблица 1.4.9. Схема приготовления калибровочных растворов эргостерола
Номер калибровочного раствора | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Калибровочный раствор эргостерола, мл | 0,05 | 0,10 | 0,15 | 0,20 | 0,25 |
Хлороформ, мл | 4,15 | 4,10 | 4,05 | 4,00 | 3,95 |
Масса эргостерола, мкг | 5,0 | 10,0 | 15,0 | 20,0 | 25,0 |
Довести объемы калибровочных растворов до 5 мл, добавив к каждому по 0,7 мл уксусного ангидрида и 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Окраска раствора при 37 оС развивается в течение 1,5 минут. Полученные зеленого цвета калибровочные растворы колориметрировать при длине волны 620 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать смесь из 0,7 мл уксусного ангидрида, 0,1 мл концентрированной серной кислоты и 4,2 мл хлороформа.
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §реактив Либермана-Бурхарда, уксусная кислота, уксусный ангидрид, концентрированная серная кислота, хлороформ, холестерол, гексан, стандартный раствор холестерола, стандартный раствор эргостерола; §кюветы с длиной оптического пути 10 мм; пипетки, колбы вместимостью 100 мл, градуирированные пробирки, делительные воронки, круглодонные колбы со шлифом вместимостью 50 мл; §аналитические весы, термостат на 37 ˚С, фотоколориметр, ротационный вакуумный испаритель. |
Реактив Либермана-Бурхарда. В сухую колбу налить 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксусного ангидрида и охладить полученную смесь до температуры 10 оС. К охлажденной смеси при постоянном перемешивании добавить 10 мл концентрированной серной кислоты. Полученный реактив должен быть бесцветным или слегка желтоватым. Хранить в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой.
Стандартный раствор холестерола (1,8 мг/мл, 4,7 ммоль/л). Навеску холестерола 0,18 г растворить в небольшом объеме хлороформа и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл. Довести объем раствора до метки тем же растворителем.
Основной раствор эргостерола (10 мг/мл). Навеску эргостерола в 1 г растворить в небольшом объеме хлороформа и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл. Довести объем раствора до метки тем же растворителем.
Стандартный раствор эргостерола (1 мг/мл). В мерную колбу вместимостью 100 мл отобрать пипеткой 10 мл основного раствора эргостерола и довести объем раствора до метки тем же растворителем.
Источник
СТЕРИНЫ
Общие сведения.
Стерины — высокомолекулярные циклические спирты, в основе строения которых лежит ядро циклопентанпергидрофенантрена. Стериды — сложные эфиры стеринов с высокомолекулярными жирными кислотами (чаще всего — пальмитиновой, стеариновой и олеиновой).
Одним из наиболее распространенных стеринов является холестерин, вторичный высокомолекулярный циклический спирт.
Холестерин — типичный представитель стеринов животного организма (зоостеринов). При дегидрировании молекулы холестерина образуется провитамин (-дегидрохолестерин). Из холестерина образуются желчные кислоты, стероидные гормоны.
Стерины, встречающиеся в растениях, называют фитостеринами. В дрожжах содержится эргостерин, который при облучении ультрафиолетовыми лучами превращается в витамин . В растительных маслах содержатся стигмастерин и -ситостерин, в бурых водорослях — фукостерин. найден в плодах малины, ежевики, грейпфрута.
К производным циклопентанпергидрофенантрена относятся также некоторые алкалоиды, гликозиды и сапонины — вещества, содержащиеся в растениях и обладающие активным физиологическим действием.
Так, агликонами гликозидов наперстянки, горицвета, ландыша и некоторых других растений, употребляющихся для лечения заболеваний сердца, являются стероиды. Имеются также данные, что гормон цветения растений относится к производным циклопентанпергидрофенантрена.
Реакция Сальковского на холестерин.
Под действием концентрированной серной кислоты происходит дегидратация молекулы холестерина с образованием холестерилена — соединения, окрашенного в красный цвет.
Реактивы: а) холестерин, 1%-ный хлороформный раствор, или растительное масло, хлороформный раствор; б) серная кислота, концентрированная ().
К 2-3 мл хлороформного раствора холестерина (или растительного масла) в пробирке осторожно, наслаивая по стенке, добавляют -2 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку легко встряхивают. Вначале верхний слой, а затем и вся жидкость в пробирке принимает красную, оранжевую или красно-фиолетовую окраску.
Реакция Либермана — Бурхарда на холестерин.
При реакции холестерина с уксусным ангидридом и серной кислотой образуются сульфокислоты холестерилена, обладающие сине-зеленой или зеленой окраской.
Реактивы: а) холестерин, хлороформный раствор, или растительное масло, хлороформный раствор; б) уксусный ангидрид; в) серная кислота, концентрированная
В пробирку наливают 2-3 мл хлороформного раствора холестерина или растительного масла, прибавляют 10 капель уксусного ангидрида и наслаивают по стенке 2—3 капли концентрированной серной кислоты. Через 5—8 мин. появляется вначале красное, затем сине-зеленое и зеленое окрашивание.
Реакция Витби на наличие стеринов в растительных маслах.
Реактивы: а) подсолнечное или другое растительное масло; б) хлороформ; в) смесь концентрированной серной кислоты с формалином .
В сухую пробирку наливают 1 мл хлороформа, добавляют 2—3 капли растительного масла и легко встряхивают для растворения масла. К хлороформному раствору масла прибавляют 20 капель смеси концентрированной серной кислоты с формалином (50:1) и встряхивают. Хлороформный слой окрашивается в яркий вишневокрасный цвет, кислотный — в тусклый красно-коричневый с зеленой флуоресценцией. Из хлороформного слоя можно отобрать пипеткой несколько капель, перенести в другую пробирку (сухую!) и добавить 2 капли уксусного ангидрида — появляется сине-зеленое окрашивание.
Источник
Определение холестерина в крови и сыворотке: методы исследования (Актуальная информация в 2021)| Сахарный диабет — лечение и профилактика СД
Холестерин это один из жиров, соединение вырабатывается печенью и имеет очень важное значение для правильного функционирования всех органов и организма в целом.
Каждая клетка нашего тела содержит в наружной мембране часть холестерина.
У животных это соединение представлено как воскообразный стероид, который транспортируется кровью. Холестерин относится к спиртам. По химической номенклатуре называется холестерол. Использовать можно оба эти названия.
Это вещество выполняет ряд функций:
- покрывает нервные волокна;
- участвует в процессе метаболизма жирорастворимых витаминов;
- принимает участие в выработке витамина Д в кожном покрове под воздействием солнечного света;
- активный компонент в процессе синтеза половых гормонов;
- участвует в производстве кортизола, альдостерона.
Для человеческого организма, нормальный уровень выработки холестерина имеет показатель от 3,5 ммоль на литр до 7,7 ммоль на литр. Хотя, если прислушиваться к рекомендациям специалистов из Великобритании, то показатель выше 6 моль на литр считается уже завышенным. При таком показателе увеличивается риск возникновения атеросклеротической патологии. Практически все врачи классифицируют показатели — миллиграмм/децилитр или миллимоль/литр, поэтому общепринятые значения могут отличаться:
- в норме содержание меньше 200 мг/дл;
- выше нормы — до 239 мг/дл;
- высокий показатель — 240 мг/дл;
- подходящий уровень — от 5 до 6,3 ммоль/л;
- незначительно завышен — от 6,4 ммоль/л;
- допустимый, но высокий — от 6,5 до 7,7 ммоль/л;
- завышенный уровень — выше 7,9 ммоль/л.
Рекомендованный уровень холестерина в сыворотке крови человека, должен составлять плотность 5 ммоль на литр.
Методы определения содержания холестерина
Современная медицина на сегодняшний день разработала много методов определения холестерина в крови.
Для одной из диагностических проверок, достаточно всего лишь обратиться ближайшую больницу.
Если присутствует в организме высокий уровень, это может привести к плохим последствиям.
В таком случае заниматься самолечением категорически запрещено.
Методики и принцип определения:
- Гравиметрический;
- Титриметрический;
- Флуориметреческий метод способен измерять холестерин при малейшем объеме сыворотки крови;
- Газохроматографический и хроматографический;
- Колориметрический метод;
- Тонкослойная хроматография;
- Газожидкостная хроматография;
- Полярографический метод способен точно определить общий холестерин в сыворотке крови, а также свободный;
- Ферментативный метод. Протекает по определенному алгоритму.
- Спектрофотометрический — зависит от содержания холестерола.
Существует также поляриметрический метод. Этот метод основан на проведении нескольких цветных реакций.
Первая реакция это Биоля-Крофта. Для неё используются уксусную кислоту и серную, при наличии холестерина раствор приобретает красный цвет.
Вторая реакция — это Ригли. Реакция заключается во взаимодействии холестерина с раствором, содержащим метанол и серную кислоту.
Третья реакция – Чугаева, основана на взаимодействии холестерина с ацетилхлоридом и хлористым цинком.
При наличии холестерина раствор приобретает красную окраску. Следующая реакция Либермана-Бурхарда. В ходе реакции происходит окисление холестерина в кислой среде, не содержащей воды.
В результате образуются сопряженные двойные связи. В результате появляется комплексное соединение изумрудно-зеленого цвета. Эта реакция отличается от остальных тем, что не имеет постоянного окрашивания. В медлитературе встречается разное соотношение компонентов реакции.
Последний Метод это реакция Калиани-Златкмса-Зака.
Мнение эксперта
Шалаева Светлана Сергеевна
эндокринолог, высшая категория, стаж 18 лет
Результат реакции должен проявиться в виде красно-фиолетового окраса раствора. Весь процесс происходит в результате окисления холестерина под влиянием серной и уксусной кислот.
Заболевания при высоком уровне холестерина в крови
Высокий уровень холестерина может привести к различным заболеваниям.
Врачи рекомендуют сдавать общий анализ крови на концентрацию холестерина каждый год.
Такой подход позволяет выявить большое количество патологий на ранних стадиях развития.
При наличии отклонений от нормы в содержании ЛПВП и ЛПНП в организме возможно возникновение ряда заболеваний, таких как:
- стенокардия;
- инсульт;
- инфаркт миокарда;
- расстройства в работе сосудистой системы;
- атеросклероз и другие патологии.
Стенокардия — это болезнь, которая характеризуется острой болью, дискомфортными ощущениями в грудной клетке. Данные симптомы спровоцированы тем сердечная мышца не получает необходимое количество кислорода и питательных веществ для нормальной работы.
Микроинсульт, инсульт. Возникает вследствие образования в крови сгустка, способного блокировать кровеносный сосуд, расположенный в головном мозге.
В результате происходит нарушение кровообращения, приводящее к постепенному отмиранию клеток определенного участка головного мозга.
Инфаркт миокарда это патология, формирующаяся при блокировке доступа крови к клеткам сердечной мышцы, в результате чего возникает кислородное голодание. Чаще всего это спровоцировано образованием тромба, расположенного в просвете коронарных артерий. Это может привести к частичной гибели сердечной мышцы.
Атеросклероз. Данная патология бывает нескольких типов.
Выделяют атеросклероз нижних конечностей, сосудов сердца, печени, почек, желудка и других органов. Возникает в результате образования атеросклеротических бляшек, которые расположены в сосудах кровеносной системы. Они затрудняют или полностью перекрывают кровоток, что приводит к нарушению кровообращения. Прогрессирование заболевания может спровоцировать наступление летального исхода.
Мнение эксперта
Шалаева Светлана Сергеевна
эндокринолог, высшая категория, стаж 18 лет
Поэтому при выявлении нарушений на ранних стадиях нужно обратиться к специалистам, чтобы не допустить образование бляшек.
Причины и симптомы повышенного холестерина
Существует множеств разных симптомов, по которым можно самостоятельно выявить наличие повышенного холестерина в крови.
Опытный специалист определяет это без исследования. Легче всего определить наличие повышенного уровня по присутствию в организме характерных нарушений в работе.
Для повышенного холестерина характерно наличие у больного следующих симптомов:
- Появление желтых пятен на кожных покровах, особенно вокруг глаз. Данный симптом имеет медицинское название — ксантома. Чаще всего это может передаваться наследственным путем.
- Появление болевых ощущений возникающих в конечностях при оказании на организм физической нагрузки. Симптом развивается в результате сужения артериальных сосудов снабжающих кровью конечности.
- Наличие стенокардии, возникающей в результате сужения коронарных артерии сердца.
- Образование мини инсульта, в результате формирования сгустков крови и разрыва сосуда.
- Развитие сердечной недостаточности, в результате недостатка в кислороде и питательных веществ.
Все причины, по которым может быть повышен холестерин в крови, разделяют на два вида изменяемые и неизменяемые.
Основным фактором, оказывающим влияние на повышение уровня холестерина в крови, является неправильное питание и неправильный образ жизни. Помимо этого на этот показатель может оказывать влияние состояние окружающей среды.
К неизменяемым факторам относятся возраст и генетическая предрасположенность в возникновении повышенной концентрации холестерина.
Основными причинами повышения холестерина являются:
- Вредные привычки. Курение является одной из основных причин возникновения патологии. Потребление алкогольных напитков может привести к алкогольной зависимости, как правило, все алкоголики имеют высокий уровень ЛПНП, а уровень ЛПВП — понижен.
- Лишний вес. Группа людей, которые страдают от лишних килограммов или ожирения обладают высоким уровнем ЛПНП. Это наблюдается чаще, чем у людей с нормальным весом.
- Неподвижный образ жизни. Для сохранения нормального уровня холестерина, нужно ежедневно делать утреннюю зарядку на протяжении 20 минут. По возможности рекомендуется ходить в спортзал на занятия с тренером, заниматься аквааэробикой, ездить на велосипеде минимум раз в неделю. У кого нет такой возможности, могут заниматься быстрой ходьбой ежедневно на протяжении 1 часа. Не рекомендуется вести малоподвижный образ жизни.
Помимо этого к основным причинам относится неправильное питание. Некоторые продукты содержат повышенное количество холестерина. Например, яйца, почки. Чтобы избежать повышенного показателя, следует придерживаться правильного питания. Рекомендуется рассчитывать количество калорий на каждый день с учетом энергетической и пищевой ценности продуктов.
Факты о холестерине рассмотрены в видео в этой статье.
Источник