Реакция сальковского на холестерин

III. Качественные реакции на холестерин и жёлчные кислоты.

1. Реакция Сальковского:

При добавлении к хлороформному раствору холестерина концентрированной серной кислоты образуется красное окрашивание. Выполнение опыта: на сухое часовое стекло наносят 1 каплю раствора холестерина в хлороформе и 1 каплю концентрированной H2SO4. Образуется красно-оранжевое окрашивание.

Холестерин (холестерол, холестен-5-ол, 3β) наиболее распространённый представитель стеринов, содержится во всех животных липидах, крови, жёлчи.

2. Обнаружение жёлчных кислот в жёлчи:

Жёлчные кислоты дают пурпурное окрашивание с оксиметилфурфуролом. Последний образуется из фруктозы (входящей в состав сахарозы) в присутствии концентрированной серной кислоты.

Порядок выполнения опыта:

На сухое часовое стекло наносят 1 каплю жёлчи, 1 каплю 20% раствора сахарозы и хорошо перемешивают стеклянной палочкой. Рядом наносят 3 капли концентрированной серной кислоты. Через некоторое время на месте слияния капель наблюдается развитие красноватой, а затем фиолетовой окраски.

IV. Качественная реакция на витамин d2 (кальциферол).

На сухое часовое стекло наносят 1 каплю витамина D2 или рыбьего жира и 2 капли раствора брома в хлороформе, перемешивают. Через некоторое время наблюдают зелёное окрашивание.

Глава 12. Адсорбция на подвижной границе раздела фаз.

Вопросы к занятию.

1. Понятие о поверхностной энергии и поверхностном натяжении.

2. Адсорбция, её основные понятия и виды.

3. Адсорбция на границе раздела жидкость — газ, жидкость — жидкость. Уравнение адсорбции Гиббса.

4. Изотерма поверхностного натяжения. Поверхностная активность.

5. Понятие о поверхностно-активных и не активных веществах. Правило Дюкло-Траубе.

6. Ориентация молекул в поверхностном слое. Понятие о липосомах, Структура биологических мембран.

7. Поверхностные явления и их роль в биологии и медицине.

Биологические структуры являются гетерогенными системами, состоящими не менее чем из двух фаз, разделяемых поверхностью раздела. Граница раздела фаз, поверхность раздела, отличается по термодинамическим параметрам от обеих фаз. Поэтому на поверх­ности раздела фаз имеют место поверхностные явления — по­верхностное натяжение, адсорбция и др. Так как многие физиологи­ческие процессы (дыхание, пищеварение, экскреция и др.) протека­ют на поверхности биомембран, для их понимания требуется знание основных закономерностей поверхностных явлений.

§ 12.1. Поверхностная энергия и поверхностное натяжение.

Поверхностный слой, возникающий на границе различных фаз, следует рассматривать как самостоятельную фазу толщиной в несколько молекул. В отдельных случаях поверхностный слой имеет толщину, равную диаметру молекулы, и его называют мономо­лекулярным. Поэтому поверхностный слой нужно рассматривать как микрогетерогенную систему.

Поверхностный слой резко отличается по своим свойствам от свойств фаз, которые он разделяет. Молекулы, атомы, ионы, нахо­дящиеся на границе раздела фаз, не равноценны тем же частицам, находящимся в объеме фазы.

Силы, действующие на молекулы, находящиеся внутри жид­кости, одинаковы со всех сторон, и их равнодействующая F равна нулю. Силы, действующие на молекулы повехностного слоя грани­цы раздела жидкости с ее паром, не одинаковы со стороны раствора (снизу и с боков) и газообразной фазы (сверху). Молекулярные взаимодействия сверху отсутствуют, равнодействущая сил F не равна нулю и направлена внутрь жидкой фазы (рис. 22). Для вы­хода молекул на поверхность требуется выполнить работу Ws про­тив этой силы. В итоге формируется поверхностный слой с избы­точной поверхностной энергией Гиббса Gs.

Рис. 22.Взаимодействие между молекулами в объеме жидкости и в поверхностном слое.

Все возможные поверхности раздела в зависимости от агрегат­ного состояния граничащих фаз делят на подвижные поверхности раздела между жидкостью и газом (ж-г), двумя несмешивающимися жидкостями (ж-ж) и неподвижные поверхности раздела между твердым телом и газом (т-г), твердым телом и жидкостью (т-ж), твердым телом и твердым телом (т-т).

При измельчении какой-либо твердой или жидкой фазы суммар­ный объем и масса остаются теми же самыми, тогда как суммарная площадь поверхности раздела возрастает.

Чтобы учесть влияние поверхности на свойства системы, вво­дят понятие удельной поверхности (Sya) фазы — величины, измеряемой суммарной площадью граничной поверхности фазы (ScyM), отнесенной к ее объему (V):

Sуд = Sсум/V

Влияние поверхности раздела фаз на свойства системы воз­растает с увеличением удельной поверхности.

Энергия Гиббса G системы из двух фаз состоит из двух сла­гаемых — энергии Гиббса объемных фаз Gv и поверхностной энер­гии Гиббса GS:

G = GV + GS.

Энергия Гиббса объемных фаз пропорциональна их массе, а, следовательно, объему, занимаемому системой:

GV = kV.

Поверхностная энергия Гиббса системы пропорциональна меж­фазной поверхности:

GV = σ S,

где σ- коэффициент пропорциональности, называемый поверх­ностным натяжением. Его величину измеряют в кДж/м2 (Н/метр) или в Дж/см2.

Поверхностное натяжение σ есть величина, измеряемая энергией Гиббса, приходящейся на единицу площади поверхностно­го слоя. Оно численно равно работе, которую необходимо совер­шить в данной системе для образования в ней единицы поверхности раздела фаз при постоянной температуре.

С учетом предыдущего получим уравнение:

G = kV + σ S

G/V= k + σ Sуд.

Следовательно, энергия Гиббса, приходящаяся на единицу объ­ема системы, линейно увеличивается с увеличением ее удельной поверхности. При малых значениях удельной поверхности Syд. по­верхностной энергией Гиббса можно пренебречь. При больших зна­чениях Sуд. с ней необходимо считаться.

Если поверхность кожи человека составляет 1.5 м2, то поверх­ность эритроцитов имеет величину уже 3000м2. Трудно оценить величину суммарной поверхности, разделяющей все клетки орга­низма, если помнить, что их общее число составляет около 1014, а к ним еще следует добавить микроорганизмы кишечной флоры, ко­личество которых больше, чем общее количество клеток организма. Организм представляет собой совокупность систем с сильно развитыми поверхностями раздела (кожные покровы, стенки кровеносных сосудов, оболочки органов, клеточные мембраны, мембраны органелл, то есть клеточных структур и т. д.). В живых системах, следовательно, величина поверхностной энергии должна иметь большую величину.

Поверхностное натяжение различных жидкостей на границе жидкость — газ возрастает с увеличением взаимодей­ствия между молекулами жидкости, являясь максимальным для во­ды из числа веществ, представленных в табл. 23.

Таблица 23

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #

Источник

Медицинская биохимия, принципы измерительных технологий в биохимии, патохимия, диагностика, биохимия злокачественного роста. Часть 2.

Методы определения содержания холестерина сыворотки крови

фото Методы определения содержания холестерина сыворотки кровиМетоды определения общего холестерина подразделяются на:

1) колориметрические. Насчитывается около 150 колориметрических методов, основывающихся на реакциях образования цветных комплексов;

2) нефелометрические методы, основанные на сравнении степени мутности стандартного и исследуемого раствора;

3) титрометрические методы;

4) флюориметрические методы, позволяющие определять холестерин в микрообъемах сыворотки крови (например, в 0,01 мл ее);

5) газохроматографические и хроматографические методы;

6) гравиметрические методы.

Метод определения общего холестерина в сыворотке крови, основанный на реакции Либермана-Бурхарда (метод Илька)

Принцип метода

В сильнокислой безводной среде ХС взаимодействует со смесью серной, уксусной кислот и уксусного ангидрида. В ходе реакции ХС последовательно окисляется. При этом каждая стадия реакции сопровождается образованием молекулы ХС, которая имеет на одну двойную связь больше, чем соединение, из которого она образовалась.

В результате конечного окисления иона 3,5-холестодиена получается окрашенное соединение, растворенное в серной кислоте и дающее максимум абсорбции при 410 и 610 нм. Из-за неустойчивости окраски соединения время фотометрирования должно быть точно выдержано.

Реакционная смесь со стандартным раствором ХС имеет изумрудный цвет. Однако пробы сыворотки могут давать зеленый, голубой, бурый цвета. Это связано с тем, что в результате образования эндогенного тепла в реакцию вступают многие компоненты сыворотки крови. Кроме того, в реакции Либермана-Бурхарда свободный ХС и его эфиры образуют цветные комплексы с разным коэффициентом молекулярного поглощения. В случае высокого содержания эфиров ХС оптическая плотность оказывается более высокой. Поскольку на прямое определение ХС влияют многие факторы, реакцию ХС со смесью Либермана-Бурхарда нельзя считать специфичной.

Прямой метод определения ХС относительно прост в исполнении и недорог. Однако токсичность и способность вызывать коррозию системы в современных анализаторах ограничивают применение метода. В крупных лабораториях предпочтение отдают ферментативным методам определения ХС.

Референтные величины: холестерин 4,65-6,46 ммоль/л (180-250 мг/дл).

При концентрации холестерина в пробе выше 16 ммоль/л сыворотку разводят физиологическим раствором в соотношении 1 : 1 (результат).

Реакция чувствительна на изменение температуры, поэтому необходимо особенно соблюдать охлаждение реакционной смеси после добавки серной кислоты.

Билирубин в концентрации выше 50 мкмоль/л влияет на результат анализа.

Интерференцию билирубина можно исправить расчетом. Содержание 17 мкмоль/л билирубина приводит к завышению содержания холестерина в сыворотке примерно на 0,1 моль/л.

Сыворотка должна быть негемолизированной.

Необходимые реактивы

1. Ледяная уксусная кислота.

2. Концентрированная серная кислота.

3. Уксусный ангидрид.

4. Абсолютный этиловый спирт.

5. Кислотная смесь: в сухую колбу наливают 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксусного ангидрида, затем при постоянном перемешивании и охлаждении добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты. Смесь должна быть бесцветной или слегка желтоватой. Хранить в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой.

6. Калибровочный раствор: 232 мг холестерина растворяют в 2-3 мл хлороформа и доводят до объема 100 мл абсолютным этиловым спиртом. Приготовленный раствор содержит холестерин в концентрации 6 ммоль/л.

Ход определения

К 2,1 мл кислотной смеси медленно по стенке пробирки добавляют 0,1 мл плазмы или сыворотки без признаков гемолиза, перемешивают встряхиванием и ставят на 20 мин в термостат или водяную баню при температуре 37 °С, затем фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см против реактива при длине волны 625 нм.

Построение калибровочной кривой и расчет.

К 0,05-0,2 мл калибровочного раствора добавляют такое количество кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 мл, перемешивают и выдерживают 20 мин при температуре 37 °С, так же как и опытные пробы, а затем фотометрируют. Окраска калибровочной пробы, в которую взято 0,05 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина в плазме 3 ммоль/л, пробы, в которую взято 0,1 мл, — содержанию 6 ммоль/л и т.д.

Примечания

1. Попадание воды приводит к помутнению раствора.

2. Следы гемолиза или желтушность исследуемой плазмы или сыворотки служат причиной завышенных результатов.

3. Можно использовать для фотометрии и кюветы с длиной оптического пути 1 см, тогда количество кислотной смеси удваивают, а количество исследуемого материала остается прежним.

Метод определения содержания холестерина в сыворотке крови, основанный на холестеролоксидазной реакции

Принцип метода

Холестерин и его эфиры выделяются из липопротеинов детергентами. Холестеринэстераза гидролизует эфиры. В результате последующего ферментативного окисления холестерина холестериноксидазой образуется Н2О2.

Эфир холестерина + Н2О2 ↔ холестерин + жирные кислоты;

Холестерин + О2 ↔ холестен-3-ОН + Н2О2;

Н2О2 + n-хлорфенол + 4-аминоантипирин ↔ хинониминовый краситель + Н2О2.

Уровни нормы ХС, выявленные при обследовании «в целом здорового населения», относительно высоки. С точки зрения риска развития ишемической болезни сердца уровни ХС желательны:

1) рекомендуемый — менее 5,18 ммоль/л;

2) умеренный риск — 5,18-6,19 ммоль/л;

3) высокий риск — более 6,22 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение

Увеличение концентрации ХС наблюдается при полигенной гиперлипопротеидемии типа II А и II Б, III, гиперлипопротеидемии I, IV, V типов, вторичной, приобретенной гиперлипопротеидемии, отмечается также при заболеваниях печени, внутри- и внепеченочном холестазе, гломерулонефрите, нефротическом синдроме, ХПН, злокачественных опухолях поджелудочной железы, простаты, гипотиреозе, подагре, ИБС, беременности, диабете, алкоголизме, анальбуминемии, дисглобулинемии, острой перемежающейся порфирии.

Снижение концентрации холестерина обнаружено при дефиците α-липопротеида (болезнь Танжера), гипо- и а-β-липопротеидемии, некрозе печеночных клеток, злокачественных опухолях печени, гипертиреозе, нарушении всасывания, нарушении питания, мегалобластной анемии, сидеробластной анемии, талассемии, острых тяжелых заболеваниях, обширных ожогах, хронических обструктивных заболеваниях легких, умственной отсталости, ревматоидном артрите, лимфангиоэктазии кишечника.

Отмечены сезонные колебания уровня ХС, более высокие осенью и зимой, более низкие весной и летом. Повторное определение ХС после инфаркта миокарда необходимо проводить через три месяца.

Метод определения содержания липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови

Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и низкой плотности (ЛПНП) в противоположность липопротеинам высокой плотности (ЛПВП) образуют нерастворимые комплексы с гепарином в присутствии ионов марганца. В надосадочной жидкости, оставшейся после осаждения ЛПНП и ЛПОНП, остается α-холестерин или ЛПВП.

Нормальное содержание ХС ЛПВП в сыворотке крови составляет 0,9-1,9 ммоль/л.

Принцип метода

Хиломикроны, ЛПОНП (липопротеины очень низкой плотности) и ЛПНП (липопротеины низкой плотности) осаждаются добавлением фосфорно-вольфрамовой кислоты и хлорида магния.

После центрифугирования супернатант содержит ЛПВП (липопротеины высокой плотности) — фракцию, содержание холестерина в которой определяется ферментативно.

Полученные значения достоверны, если:

1) в пробе нет хиломикронов;

2) концентрация триацилглицеридов не превышает 400 мг/100 мл;

3) в пробах не обнаруживается следов III типа дислипопротеинемии.

При измерении на Hg 546 нм происходит завышение количества ЛПВП холестерина спектром поглощения гемоглобина, которое можно игнорировать при значениях до 200 мг Нb/100 мл.

Полученный при центрифугировании супернатант должен быть прозрачен. Если проба содержит большое количество триглицеридов (более 1000 мг/100 мл), осаждение липопротеинов может быть неполным (мутный супернатант) или часть осадка может плавать на поверхности. В этих случаях развести образец 1 : 1 0,9%-ным раствором NaCl и повторить осаждение.

Клинико-диагностическое значение ХС-ЛПВП

Эпидемиологические исследования показали обратную зависимость между уровнями ХС-ЛПВП и распространенностью ИБС. Определение ХС-ЛПВП способствует выявлению риска развития ИБС.

Повышению уровня ХС-ЛПВП способствуют такие заболевания, как первичный билиарный цирроз, хронический гепатит, алкоголизм, прочие хронические интоксикации.

Источник