Соединение азота с гемоглобином

Комплексы оксида азота с гемоглобином и парамагнитные металлоферменты в мозге и крови млекопитающих после кратковременной гипоксии

В настоящее время считается установленным фактом, что ведущими причинами гибели нейронов при поражениях мозга (инсульт, ишемия/гипоксия, нейродегенеративные процессы и черепно-мозговые травмы) являются токсическое воздействие глутамата (Glu-каскад), изменение возбудимости нейронов, разрушение гематоэнцефалического барьера, образование аутоантител к Glu-рецепторам, потенцирующее действие альбумина крови, повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+, активация NO-синтаз и повышение концентрации свободнорадикальных соединений — ·NO, ·NO2 и ·O2- [1-18]. Установлено, что при этом происходит изменение ультраструктуры нейронов [19-23], а также активирование процессов образования нейроглиальных контактов [23]. Все эти процессы осуществляются на фоне разной степени гипоксии [24-31].

Гипоксия относится к состоянию, при котором организм, отдельные органы и ткани испытывают недостаток кислорода. Практически любые экстремальные условия и любой патологический процесс в живых организмах прямо или косвенно связаны с нарушением кислородной обеспеченности [4, 32-34]. В связи с этим считают, что гипоксия является наиболее распространенным патологическим состоянием живого организма [27, 28]. В первую очередь при гипоксии страдает мозг. Метаболические нарушения, вызванные гипоксией, являются ведущими патогенетическими факторами всех тяжелых осложнений при экстремальных состояниях и патологических процессах самого различного генеза [1, 2, 33]. При гипоксии интенсифицируется процесс образования оксида азота (·NO) в крови и тканях в результате повышения активности NO-синтазных и нитритредуктазных систем [29, 30, 35-40].

Известно, что современный человек живет в условиях нитратно-нитритной нагрузки, связанной с поступлением в организм нитратов и нитритов из продуктов питания, воды, лекарственных препаратов [27, 28, 32]. Повышение содержания нитратов и нитритов в крови и тканях выше физиологических концентраций (10-5-10-6 М) может приводить к нарушению циклов NO и супероксидного анион-радикала, при которых ·NO и ·О2- могут непосредственно взаимодействовать друг с другом с образованием анионов пероксинитритов. После протонирования анионы пероксинитритов могут распадаться с высвобождением ·NO2 и ·ОН-радикалов, что может приводить к повреждению мембран клеток, субклеточных структур, гематоэнцефалического барьера, а также стимулировать образование атеросклеротических бляшек, развитие ишемического и геморрагического повреждений [5, 7, 14, 25, 26].

Нитритные ионы, поступающие в живой организм, способны при участии гемсодержащих белков крови и тканей, находящихся в дезокси-форме, восстанавливаться в NO [11, 41-44]. Однако в настоящее время практически отсутствуют работы, авторы которых анализируют соотношение между интенсивностью образования NO в крови и мозге.

Цель настоящей работы — исследование действия гипоксии на образование NO в крови и мозге крыс, а также влияния на процесс генерации NO в условиях гипоксии ингибитора NO-синтазы — L-NNA и нитрита натрия при раздельном и одновременном введении этих соединений в организм животных.

В экспериментах использовали крыс-самцов (42) линии Крушинского-Молодкиной (К-М) в возрасте 4,5 мес с массой 260±40 г. Стандартизацию животных осуществляли в результате отбора крыс по возрасту, массе тела, полу. Крысы содержались в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище, с естественной сменой дня и ночи, t=20 °C, по 6-7 животных в клетке. Было поставлено 7 серий экспериментов с участием 6 животных в каждом эксперименте: 1 — контроль, при котором животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор; 2 — опыт с выдерживанием животных в барокамере (равноценно подъему животных на высоту 5000 м, гипоксия), которым внутрибрюшинно вводили физиологический раствор; 3 — опыт с введением животным L-NNA в физиологическом растворе; 4 — опыт с введением L-NNA в физиологическом растворе на фоне гипоксии; 5 — опыт с введением NaNO2 в физиологическом растворе; 6 — опыт с введением NaNO2 в физиологическом растворе на фоне гипоксии; 7 — опыт с сочетанным введением NaNO2 и L-NNA в физиологическом растворе на фоне гипоксии.

Нитрит натрия в дозе 0,5 мг на 100 г массы тела, а также L-NNA в дозе 2,5 мг на 100 г массы тела вводили внутрибрюшинно. Все экспериментальные воздействия с введением NaNO2, L-NNA и «подъем на высоту» 5000 м осуществляли в течение 60 мин, после чего животных декапитировали, а кровь и ткани использовали для приготовления образцов для исследования методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР-исследование).

Изменение содержания NO оценивали методом ЭПР по интенсивности сигналов нитрозильных комплексов гемоглобина (Hb-NO) в спектрах ЭПР образцов крови. Образцы крови были приготовлены в виде столбиков высотой 30 мм и диаметром 3 мм и заморожены при 77 К. Спектры ЭПР приготовленных образцов регистрировали на спектрометре Х-диапазона ESP-300 («Bruker-Analitishe-Messtechnik», Германия). Во избежание эффектов насыщения, сигналы ЭПР образцов тканей записывали при мощности СВЧ 20 mW, амплитуда модуляции магнитного поля — 4 Гс, температура измерения спектров — 77 К [24, 34]. Интенсивность сигнала парамагнитных комплексов оксида азота с гемоглобином (Hb-NO) определяли в относительных единицах по величине амплитуды широкого сигнала ЭПР с g-фактором 2,02, что пропорционально количеству комплексов Hb-NO в образце [34].

В 1-й серии экспериментов было исследовано влияние барокамерной (гипобарическая) гипоксии крыс линии К-М, на образование Hb-NO-комплексов в крови. На рис. 1 приведены спектры ЭПР Hb-NO комплексов, образующихся в крови линии К-М при кратковременной адаптации к гипоксии (см. рис. 1, кривая 1) и в контроле (без каких-либо воздействий) (см. рис. 1, кривая 2). Проведенные эксперименты и анализ полученных данных показали, что «подъем» крыс на высоту 5000 м приводит к повышению содержания комплексов Hb-NO в крови приблизительно в 2 раза.

Рис. 1. Спектры ЭПР образцов крови крыс линии К-М. 1 — в контроле; 2 — при гипоксии. Коэффициент усиления сигнала ЭПР крови крыс линии К-М при гипоксии в 2 раза меньше, чем в контроле.

На рис. 2 представлены данные, отражающие изменения содержания комплексов Hb-NO в опытных вариантах. Показано, что в присутствии ингибитора L-NNA интенсивность сигнала ЭПР Hb-NO-комплексов снижалась в 2,5 раза (15,2±3,1 отн. ед. в контроле и 6,0±2,5 отн. ед. в опыте) (см. рис. 2, а, столбцы 1, 2). Этот факт может свидетельствовать о том, что при физиологических условиях (нормоксия) ингибитор NO-cинтазы L-NNA действительно снижает синтез NO благодаря своей способности частично блокировать образование NO из L-аргинина на уровне фермента NO-синтазы. Однако гипоксия крыс приводила к тому, что интенсивность сигнала ЭПР Hb-NO, образующихся в крови животных на фоне действия ингибитора NO-синтазы L-NNA, не только не снижалась, но и оказывалась выше в 1,5 раза по сравнению с контролем (см. рис. 2, а, столбцы 1, 3) и в 3,8 раза выше по сравнению с опытом, когда крысам вводили только L-NNA (см. рис. 2, а, столбцы 2, 3). Эти данные могли бы свидетельствовать о наличии дополнительного источника NO в организме крыс, который эффективно работает только в условиях гипоксии при недостатке кислорода в тканях.

Рис. 2. Изменение содержания комплексов Hb-NO (в отн. ед.) в 7 экспериментальных вариантах. Без введения (1- 4, рис., а) и на фоне введения NaNO2 (5-7): 1 — контроль; 2-гипоксия;3 — на фоне введения ингибитора NO-синтазы L-NNA; 4 — на фоне введения ингибитора NO-синтазы L-NNA и гипоксии; 5 — на фоне введения NaNO2; 6 — на фоне введения NaNO2 и гипоксии; 7 — на фоне введения ингибитора NO-синтазы L-NNA и введения NaNO2 на фоне гипоксии.

Источником образования дополнительного количества NO могут быть молекулы ингибитора L-NNA, которые содержат в своем составе нитрогруппу (-NO2). Известно, что нитриты и нитрогруппы являются эффективными акцепторами электронов [24, 34, 43]. Таким образом, в условиях гипоксии восстановление нитроаргинина до нитрозоаргинина происходит относительно беспрепятственно, и мы наблюдаем существенный рост в крови комплексов Hb-NO в результате высвобождения NO и связывания его с гемоглобином. В условиях дефицита кислорода нитриты (ионы NO2-) способны, как было ранее показано, восстанавливаться в NO гемсодержащими белками, находящимися в дезокси-форме [41-43]. Результаты наших исследований были подтверждены зарубежными коллегами [45]. В настоящей работе мы сочли целесообразным более детально исследовать влияние гипоксии на фоне раздельного и одновременного действия NaNO2 и L-NNA. Показано, что гипоксия в присутствии NaNO2 приводила к повышению интенсивности сигнала ЭПР комплексов Hb-NOв 2,2 раза (192,7±8,3 отн. ед. — в присутствии только одного NaNO2 и 427±76,5 отн. ед. — гипоксия на фоне действия NaNO2) (см. рис. 2, столбцы 4, 5). Полученные экспериментальные данные прежде всего свидетельствуют о том, что при использованной концентрации NaNO2 вполне можно пренебречь образованием NO в результате работы NO-синтаз, поскольку интенсивность Hb-NO-комплексов в этом случае была больше на порядок по сравнению с контролем (192,7±8,3 отн. ед. в присутствии NaNO2 и 15,2±3,1 отн. ед. — в контроле).

Основным механизмом образования NO из ионов NO2- могло быть одноэлектронное восстановление нитритов в NO дезоксигемоглобином [41, 45]. Поэтому можно было ожидать, что в условиях дефицита кислорода, связанного с «подъемом» крыс на высоту, будут активироваться процессы восстановления нитритов в NO при участии гемоглобина, частично находящегося в этих условиях в дезокси-форме [24, 41, 45]. Вторым механизмом мог быть механизм неферментативного синтеза за счет внутриклеточного ацидоза, который, как известно, имеет место при ишемии и гипоксии различного генеза [46]. Однако в связи с тем, что в крови присутствует мощная буферная система, способная предотвратить колебания рН при различных экстремальных условиях, механизм неферментативного синтеза NO из нитритных ионов за счет внутриклеточного ацидоза представляется маловероятным.

Естественно, интересно было узнать, как может измениться образование комплексов Hb-NO при сочетанном воздействии NaNO2 и L-NNA. Проведенные эксперименты показали, что в присутствии L-NNA и NaNO2 гипоксия приводит к резкому повышению интенсивности сигнала ЭПР комплексов Hb-NO в 5,9 раза по сравнению с контролем (см. рис. 2, столбцы 4-6). Эти данные указывают на то, что в крови крыс при сочетанном воздействии L-NNA и NaNO2 источником NO могут выступать, участвуя в восстановительных процессах, оба эти соединения. Гипоксия/ишемия способны интенсифицировать процесс восстановления L-NNA и нитрита. Группы NO2, присутствующие в L-NNA и в NaNO2, в этих экспериментальных условиях становятся эффективными акцепторами электронов и восстанавливаются в NO, о чем свидетельствует возрастание интенсивности сигнала комплексов Hb-NO в 2,2 и 5,9 раза по сравнению с контролем (см. рис. 2, столбцы 4-6).

Следует отметить, что в ткани мозга после введения животным NaNO2 сигнал ЭПР нитрозильных комплексов Hb-NO вообще не регистрируется (рис. 3). Однако при гипоксии с предварительно введенным NaNO2 этот сигнал хорошо наблюдается. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в условиях кратковременной гипоксии интенсифицируются процессы восстановления ионов NO2- в NO и образование нитрозильных комплексов Hb-NO.

Рис. 3. Спектры ЭПР образцов тканей мозга животных. 1 — гипоксия после введения NaNo2; 2 — контрольные животные; 3 — спектр ЭПР, полученный при вычитании спектра 2 из спектра 1.

В серии опытов на фоне предварительно введенных NaNO2 и нитроаргинина (L-NNA) сигнал ЭПР нитрозильных комплексов Hb-NO значительно увеличивается. Сравнение проводили с серией опытов после предварительного введения NaNO2. Эти данные указывают, что в условиях гипоксии вклад в образование нитрозильных комплексов Hb-NO могут вносить не только ионы NO2- от NaNO2, но и нитрогруппы L-NNA. В чистом виде сигнал ЭПР нитрозильных комплексов Hb-NO был выделен путем вычитания спектров из серии опытов NaNO2 и L-NNA и гипоксия и спектров из серии опытов с NaNO2 (см. рис. 3 и 4). Нами был проведен сравнительный анализ спектров ЭПР образцов мозга и спектров сердца, описанных в работе [12], который показал, что в спектрах ЭПР образцов мозга значительно меньше интенсивность компоненты с g-фактором 1,98, которая обусловлена взаимодействием NO с оксигенированными (в R-состоянии) субъединицами гемоглобина. Из этого следует, что при использовании комплекса всех изучаемых воздействий (NaNO2 и L-NNA и гипоксия) мозг испытывает больший недостаток в кислороде, чем сердце.

Рис. 4. Спектры ЭПР образцов тканей мозга животных. 1 — гипоксия после введения NaNo2 и нитроаргинина; 2 — после введения NaNo2; 3 — спектр ЭПР, полученный при вычитании спектра 2 из спектра 1.

На рис. 5 показаны изменения интенсивности железосерных центров (ЖСЦ) дыхательной цепи митохондрий мозга при всех изучаемых воздействиях. За наблюдаемый сигнал ЭПР с g-фактором 1,94 (см. рис. 1, 2 и 4) ответственны центры N1-b 1-го комплекса Грина. Известно, что эти центры регистрируются в восстановленном состоянии. В условиях увеличения окисленности (или при увеличении факторов окисления) интенсивность этого сигнала снижается. Анализ данных (см. рис. 5) показывает, что интенсивность сигнала ЖСЦ снижена по сравнению с интенсивностью в норме, при действии нитрита натрия и других воздействиях на фоне введенного нитрита натрия. И это снижение интенсивности сигналов ЭПР ЖСЦ, наблюдаемое в опытах 4-6, свидетельствует о повышении окисленности центров N1-b 1-го комплекса Грина. Сравнение данных о снижении сигналов ЖСЦ в тканях мозга и данных о снижении интенсивности сигнала ЭПР нитрозильных комплексов, обусловленных оксигенированными субъединицами гемоглобина в тканях сердца, которые были приведены в работе [28], указывают на то, что мозг испытывает больший недостаток кислорода при изучаемых воздействиях, чем ткани сердца. Таким образом, если в образцах мозга после введения NaNO2 сигнал ЭПР комплексов Hb-NO не регистрируется, то после гипоксии с введенным NaNO2 этот сигнал хорошо наблюдается и в самом спектре ЭПР и в разностном спектре (см. рис. 3).

Рис. 5. Изменение интенсивности сигнала ЭПР (в отн. ед.) железосерных центров в мозге. 1 — контроль; 2 — введение ингибитора NO-синтазы L-NNA; 3 — введение L-NNA и гипоксия; 4 — введение NaNO2; 5 — введение NaNO2 и гипоксия; 6 — введение NaNO2 и ингибитора NO-синтазы L-NNA на фоне гипоксии.

В настоящее время известно, что значительную роль в механизмах адаптации организма к гипоксии играют NO и продукты его превращения [25-27, 31]. Проведенные нами ранее исследования свидетельствуют, что NO участвует в протективном эффекте кратковременной адаптации к гипоксии при аудиогенных стрессорных повреждениях [14, 15, 25, 26]. При этом положительная составляющая этого эффекта осуществляется за счет умеренного увеличенияNO в крови и в сердце [27-29, 47-50].

Известно, что NO выполняет в мозге регуляторную и нейропротективную роли [6, 25, 26]. Вместе с тем NO и продукты его превращения обладают цитотоксическими свойствами и могут быть одним из факторов повреждения и гибели нейронов [1, 2]. При воздействии на нейроны NO-генерирующих соединений и глутамата отмечаются набухание, отек нейронов и целый ряд других патологических изменений [4, 19]. Показано, что морфофункциональные изменения нейронов и глиальных клеток обусловлены образованием в них повышенных концентраций NO и продуктов его превращений [1, 2, 20-23]. При эпилепсии и гипоксии NO участвует в повреждении глутаматных рецепторов и образовании аутоантител [8-10]. NO-генерирующие соединения и нитриты также участвуют в изменении ультраструктуры нейронной сети молекулярного и зернистого слоев мозжечка, а также образовании нейроглиальных контактов [17, 23]. Такая роль NO в мозге при различных физиологических и патологических состояниях определяется многими факторами [1, 2, 4]. Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о том, что продукция NO в мозге по сравнению с кровью в значительной степени снижена, причем, не только при физиологических условиях, но даже после введения умеренных доз NaNO2. При кратковременной гипоксии интенсифицируются процессы восстановления ионов NO2- в NO и образование нитрозильных Hb-NO-комплексов не только в крови, но и в мозге, хотя и в разной степени.

Авторы выражают благодарность старшему лаборанту и инженеру В.С. Кузенкову за оказание технической помощи при проведении экспериментов. Работа выполнена при частичной поддержке (для А.Л. Крушинского) гранта РФФИ 12−04−00360 а.

Источник