Задачи на содержание гемоглобина

Необходимые животные и оборудование на 1 рабочее место:

1. Кролик с постгеморрагической анемией (постгеморрагическую анемию у кролика вызывают за 4 — 5 дней до занятия кровопусканием из бедренной артерии) в количестве 2% от массы тела.

2. Кролик с гемолитической анемией (гемолитическую анемию у кролика вызывают подкожным введением за 5-6 дней до занятия 2,5% раствора фенилгидразина солянокислого в количестве 0,6 мл на кг массы в течение 3 дней)

3. Гемометр Сали (с пипеткой и пробирками).

4. Соляная кислота 0,1 н. раствор — 5,0 мл.

5. Глазная пипетка — 2 шт.

6. Дистиллированвая вода 5,0 мл.

7. Инъекционная игла.

8. Вата — 5,0 г.

Ход исследования:

В градуированную пробирку гемометра Сали до метки 1,0 наливают 0,1 н. раствор HCl. Кровь набирают в пипетку от гемометра до метки 0,02 мл (20 мкл), обтирают наружную часть капилляра ватой и осторожно (избегая образования пены) выдувают в соляную кислоту на дно пробирки. Несколько раз ополаскивают капилляр раствором соляной кислоты и затем пробирку встряхивают (для смешения крови с соляной кислотой) и далее оставляют пробирку на 1О — 15 минут. Жидкость в пробирке приобретает коричневый цвет вследствие образования солянокислого гематина. При добавлении дистиллированной воды уравнивают цвет жидкостей в пробирке с цветом стандартного раствора. Цифра на пробирке соответствует количеству гемоглобина в исследуемой крови в условных единицах, а также и в г/л. В том случае, если на пробирке указаны только условные единицы, то для перевода в г/л необходимо полученную цифру условных единиц умножить на 6.

Нормальное содержание гемоглобина у мужчин 12-16г%, у женщин 12-14г%.

Задание 2. Перерасчет содержания гемоглобина в крови в г%, в г/л и в %.

Содержание гемоглобина в крови выражается как абсолютных единицах (г/л, г/100мл ), так и в относительных единицах ( в %). Для всех расчетов принимается показатель содержания гемоглобина в крови, составляющий 166,7г/л (соответственно 166,7г/100 мл или 16,67г%). Эта величина соответствует максимальной концентрации гемоглобина, т.е. при максимальном насыщении гемоглобином одного эритроцита и при содержании в крои эритроцитов 5 ×1012/л. Ее принимают за 100%. Таким образом, 16,67г гемоглобина в 100 мл крови также равно 100%. При необходимости перевода в % любого показателя, выраженного в абсолютных единицах составляется пропрция:

6

16,67 г/дл Hb – 100% A × 100

x = _______________ = A × 6

А г/л Hb – х % 16,67

Таким образом, для перевода абсолютных показателей гемоглобина ( вг/100мл) в относительные (%), абсолютные показатели умножают на 6. Соответственно, при переводе относительных показателей в абсолютные, относительную величину делят на 6.

Рассчитатьотносительные показатели содержания гемоглобина в крови при следующих абсолютных показателях:

12 г%

11 г%

8 г%

70 г/л

Задание 3. Определение количества эритроцитов в 1 л крови

Необходимые животные в оборудование на 1 рабочее место:

1. Кролики те же, что в задании 1.

2 Пробирки.

3. Счетная камера Горяева.

4. 1% раствор NaCl.

5. Инъекционная игла.

6. Вата — 5 г.

7. Микроскоп с ок. 10, об. 8.

Ход исследования:

Кровь от животного (кролика) с экспериментальной анемией набирают из краевой вены уха в капилляр гемометра Сали (0,02мл), затем переносят в пробирку с 4 мл раствора NaCl и тщательно перемешивают. Полученное разведение составляет 1:202 и практически его можно принять 1:200. Небольшую каплю смеси помещают на площадку счетной камеры (Горяева) под предварительно притертое покровное стекло. Через 1- 2 минуты (когда эритроциты осядут на дно камеры) начинают подсчет эритроцитов, пользуясь увеличением микроскопа 20 х 8 при вогнутом зеркале и опущенном конденсоре. Подсчет ведут в 5 больших квадратах, каждый из которых разделен на 16 малых. Таким образом, всего сосчитываются эритроциты в 80 малых квадратах, в разных участках камеры по диагонали. Для исключения возможности подсчета дважды одной и той же клетки (расположенной на границе квадрата) считают в данном квадрате все эритроциты, находящиеся на левой и нижней границах квадрата.

Определяют количество эритроцитов в л крови по формуле:

а · 200 · 4000 = а ·10 000 ,

где: а — количество эритроцитов, сосчитанных в 8О малых квадратах;

200 — разведение крови в смесителе,

4000 -множитель объема жидкости малого квадрата ( объем малого квадрата равен 1/4000 куб.мм),приводящий к объему в куб. мм.

80- количество сосчитанных малых квадратов.

Найденное количество эритроцитов в 1 куб. мм для выражения их содержания в 1 литре умножают на 10 6.

Нормальное количество эритроцитов в крови 4,5-5,0·10 12/л

. Содержание гемоглобина в норме приведено в таблице 16.

Таблица 16 —Содержание гемоглобина в норме

А). Гематиновый метод (метод Сали).

Цель работы: освоить калориметрический способ определения гемоглобина с помощью гемометра Сали.

Основан на превращении гемоглобина при добавлении к крови хлористоводородной кислоты в хлорид гематина коричневого цвета. В учебных целях используют гемометр Сали, состоящий из трех пробирок одинакового диаметра (рис.18). Одна (средняя) пробирка – пустая и сверху открыта, две другие запаянные и содержат стандартный раствор солянокислого гематина определенной окраски.

Оборудование:гемометр Сали, 0,1 % раствор НСl, смеситель, стерильный скарификатор, пипетка, дистиллированная вода, стеклянная палочка, спирт, вата.

Рис. 18 Гемометр Сали

1 — пробирки со стандартным раствором;

2 — градуированная пробирка с исследуемой кровью;

3 -смеситель;

4 — пипетка;

5 — палочка для смешивания.

ХОД РАБОТЫ

1.В градуированную пробирку гемометра Сали налить 0,1 % раствор соляной кислоты до нижней круговой метки – 0,2 мл.

2.Приготовить смеситель к забору крови (на тупой конец надеть резину, промыть водой и продуть).

3.Ватным тампоном протереть мякоть 4-го пальца левой руки и скарификатором проколоть палец

4.Первую каплю крови стереть сухим тампоном. Во вторую каплю погрузить кончик смесителя, держа его вертикально. Набрать крови до метки 0,2 мл.

5.Смеситель погрузить в градуированную пробирку гемометра и выдуть из нее кровь на дно пробирки.

6.Смеситель промыть 2-3 раза 0,1% раствором соляной кислоты из верхнего прозрачного слоя.

7.Содержимое пробирки тщательно перемешать, ударяя пальцем по ее концу и помешивать палочкой, а потом оставить на 5 минут.

8.В пробирку с раствором, размешивая палочкой, по каплям внести дистиллированную воду до полного совпадения цвета жидкости в градуированной пробирке с цветом стандарта.

9.Показания гемометра снять по нижнему мениску жидкости в градуированной пробирке.

Градуированная пробирка гемометра имеет две шкалы, нанесенные с обеих сторон. Одна шкала (с делениями от 2 до 23) показывает количество гемоглобина в граммах на 100 мл крови, грамм-процент (г%) гемоглобина. Вторая шкала (с делениями от 12 до 140) показывает единицы гемометра (или относительный процент гемоглобина), при этом 100 единиц (или 100% по гемометру Сали) означают, что в 100 мл крови содержится 16,67 г гемоглобина, или 100 единиц соответствует 16,67 г%.

10. Вычисление концентрации гемоглобина по формулам в г%, % и г/л

Пример 1. Равенство красок достигнуто на отметке 15 г% гемоглобина. Для расчета концентрации Hb в относительных процентах применяется формула:

Формула для расчета: Х = (100 % х 15 г%)/16,7 г%,

где Х – относительное содержание гемоглобина, %.

16,7 – стандартная концентрация Hb в г%.

Пример 2. Равенство красок достигнуто на отметке 80. Следовательно, исследуемая кровь содержит 80 % гемоглобина по сравнению со стандартом (16,7 г%)

Формула для расчета: Х = (16,7 г% х 80 %)/100 %,

где Х – количество гемоглобина в г%

Для того чтобы выразить концентрацию гемоглобина в граммах на литр (г/л), нужно количество гемоглобина в г% умножить на 10.

Пример 3. Гемоглобин – 13,5г% = 13,5 х 10 = 135 г/л.

Грамм процентное обозначение гемоглобина имеет преимущества перед обозначением просто в единицах, так как оно дает реальную количественную величину концентрации гемоглобина.

Оформление протокола

1. Определите концентрацию гемоглобина.

2. Занесите данные в таблицу 17

Таблица 17. —Собственные результаты исследований

1. Сделайте заключение о соответствии полученных вами данных нормативным.

Б).Гемоглобинцианидный метод(сиспользованием фотометрического гемоглобинометра АГФ – 03/540 – «Минигем».

Оборудование:гемоглобинометр АГФ – 03/540 – «Минигем», трансформирующий раствор,стерильный скарификатор, гемоглобиновый капилляр (0.02 мл), пипетка с грушей (5мл), дистиллированная вода, стеклянная палочка, спирт, вата.

Ход работы:

1.Проверить оптический ноль прибора (в соответствии с техническим паспортом прибора).

2.Подготовить пробирки с трансформирующим раствором в объеме -5 мл.

3. Произвести забор капиллярной крови в гемоглобиновый капилляр и перенести в пробирки с трансформирующим раствором.

4. Тщательно перемешать стеклянной палочкой.

5.Через 20 мин. провести замер пробы, для чего перелить в оптическую кювету реакционную смесь из очередной пробирки и установить кювету в фотометрическую ячейку прибора.

6.Появление звукового сигнала свидетельствует о фотометрировании и на индикаторе появляется число, соответствующее концентрации гемоглобина (в гр./л).

7. Вылить содержимое кюветы, удалить оставшиеся капли с верхнего края кюветы при помощи бинта и перейти к очередному замеру.

Контрольные вопросы для самостоятельного изучения:

1.Строение молекулы гемоглобина

2.Строение молекулы миоглобина.

3.Соединения гемоглобина с различными газами и их значение.

4.Функции гемоглобина.

5.Функции миоглобина.

6.Как определить содержание гемоглобина в крови.

7.Типы гемоглобина у эмбриона, плода, новорожденного и детей раннего возраста.